神经生长因子对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤的保护作用研究

郁俊德

神经生长因子 NGF是神经系统最主要的神经营养因子之一,它通过效应神经细胞上的受体 trkA结合,能诱导神经纤维定向生长,控制神经细胞存活数量和分化,促进损伤神经细胞的修复,参与神经细胞的凋亡过程。新生儿缺血缺氧性脑损伤是新生儿常见的中枢神经系统疾病,病死率和致残率高,是严重威胁新生儿生命和健康的疾病之一,为了观察 NGF对新生大鼠 HIE的保护作用,本实验采用新生大鼠 HIE模型进行NGF保护 HIE的作用的研究。

1 资料与方法

1.1 实验动物和分组 新生 7d龄 Wistar大鼠购买自中科院上海实验动物中心,体质量 9～17g,雌雄不限,随机分为假手术组 (仅分离左侧颈总动脉,不结扎)、HIE组、NGF治疗组。

1.2 实验药物和仪器 神经生长因子动干粉:本实验室提供,临用时用 0.9%氯化钠溶液稀释至一定浓度。0.9%氯化钠溶液:苏州第六制药厂。氮氧混合气 (氧浓度 8%):上海五钢气体公司。电热恒温水温箱:上海医疗器械七厂。

1.3 方法

1.3.1 HIE模型的建立和给药方法 7d龄新生大鼠仰位固定在手术板上,酒精消毒颈部皮肤,剪开颈部皮肤,分离左侧颈总动脉并用 0号线永久结扎,用 5/0号缝合线一次性缝合切口,手术在白炽灯下进行。术后将大鼠直接放入自制的新生大鼠缺氧装置中[1],2h后取出,制成 HIE模型,返回母鼠身边继续喂养。NGF组术前半小时和缺氧后都注射 NGF,其他组注射 0.9%氯化钠溶液。剂量分别为:NGF 0.02mg/10g,0.9%氯化钠溶液 0.25mg/10g。

1.3.2 免疫组化检测 新生大鼠在制成模型并喂养 44h后,处死并取出脑组织,均匀分离左右半脑,放入 4%的多聚甲醛进行固定 24h,常规脱水、透明、石蜡包埋、组织切片 (4μm厚)、分别进行苏木素-伊红 (HE)染色和免疫组化检测,包括促进细胞凋亡的 p53蛋白和抑制细胞凋亡基因 bcl-2[2]。每次实验均设阴性对照,以 PBS代替一抗。阳性反应为胞质内呈棕黄色染色,阴性结果为胞质内无棕黄色。在高倍镜下观察同一实视野下 100个细胞中棕黄色颗粒数来计算 p53和 bcl-2的表达。

2 结果

HIE组 p53表达明显高于假手术组,NGF干预后 p53下降显著;而 bcl-2正好相反,HIE组较假手术对照组表达降低,NGF干预组 bcl-2表达显著增加 (P＜0.05,见表1)。

表1 3组各指标比较Table1 Comparison ofsome indexes in three groups

3 讨论

NGF是一种多亚基蛋白组成的靶组织源性修复细胞因子,它的生物学活性分为两种[3]:一是使神经细胞存活率增高的活性 (生存活性);二是促进神经细胞突起的伸长的活性 (神经突起伸长活性)。具体表现在以下几方面:(1)NGF促进发育中的交感和感觉神经细胞的分化和成熟,维持交感神经元的正常功能。(2)促进离体培养的交感神经元和感觉神经元突起的长出。诱导突起向 NGF浓度高的方向生长,决定神经纤维生长的方向,具有趋化性,表现在细胞器增大,酶合成活性增加。(3)促进神经细胞内 Ca2+向细胞外释放。(4)影响免疫系统的肥大细胞、巨噬细胞和胸腺细胞的功能。(5)NGF可抑制某些肿瘤的有丝分裂,促其向良性分化,延长患者的存活期。(6)NGF可促进创伤组织细胞的修复反应,促进伤口愈合。

NGF对神经细胞保护作用的机制可能与以下几方面有关[4]:(1)提高自由基清除剂的活力。因为在各种脑损伤时,脑组织中氧自由基的产生和脂质过氧反应均异常活跃,NGF能增加过氧化氢酶、超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱光肽、谷胱光肽过氧化酶等自由基清除剂的活性,从而减轻脑损伤。(2)拮抗兴奋性氨基酸的神经毒性。兴奋性氨基酸 (EAA)参与了多种原因所致的神经细胞损伤和死亡。在脑缺血缺氧时,脑内 EAA释放增多,从而持续的刺激 EAA受体 (包括NMDA和非 NMDA受体)引起的神经元兴奋性损伤。NGF具有抵消 EAA兴奋毒性的作用。目前认为,NGF并不能减少NMDA受体的表达,但能影响细胞膜上的离子泵,如 NGF稳定细胞内 Na+/K+浓度比,缓解 EAA的神经毒性。也有人认为,NGF通过激活 trkA受体引起细胞内一系列继发性变化,如改变谷氨酸受体对刺激的反应性。(3)稳定细胞内 Ca2+浓度。自由基和 EAA损伤均可引起细胞内钙超载,钙超载将预示细胞发生破坏和死亡。NGF稳定细胞内 Ca2+浓度的机制在于诱导钙结合蛋白的表达、影响钙通道与钙排出系统的表达和活化,从而促进 Ca2+的排出和 (或)缓冲细胞内 Ca2+浓度的上升,以及减少 Ca2+的内流。

细胞凋亡在缺血缺氧性脑细胞受损的重要机制[5],最近一些研究提示迟发性神经细胞死亡与神经细胞凋亡有关[6]。细胞凋亡是细胞在生理或病理条件下的一种主动死亡方式,是受细胞内基因及细胞外一些因子调控的生物学过程[7]。

本实验是采用观察缺血缺氧后新生大鼠脑组织中 p53、bcl-2的表达来探讨 NGF对缺血缺氧脑损伤的保护。其中,p53在调节细胞凋亡中起重要的作用,野生型 p53可以抑制肿瘤细胞的发生,正常 p53功能的改变或缺失与大量不同种类的人类肿瘤细胞有密切关系。p53还被认为是细胞应激的关键性调控分子之一,能整合各种不同细胞危急事件的信号,通过转录或非转录途径对这些信号做出包括细胞生长抑制或凋亡在内的不同反应。还有研究认为正常 p53在体内扮演 “分子警察”的角色,监视细胞基因组的完整性。许多研究表明,多种因素诱导的细胞凋亡都有 p53基因的参与。而 bcl-2是 80年代从滤泡性淋巴瘤细胞中分离发现的一种癌基因,其过度、异常的表达可以抑制包括淋巴细胞的凋亡过程,具有延缓细胞衰亡的作用,故被称为 “细胞长寿基因”,能抑制许多因素引起的细胞凋亡。大量研究表明,bcl-2表达在多种造血细胞、某些正常上皮和乳腺癌、肺癌、前列腺癌等上皮恶性肿瘤中,由于 bcl-2表达与癌前病变组织密切相关,提示 bcl-2是在肿瘤发生早期起作用,而并不影响肿瘤的增殖。本实验中,HIE组中由于没有 NGF的治疗,脑中 p53的表达明显高于假手术组,在高倍镜中能明显观察到新生大鼠脑组织中典型的细胞凋亡形态:细胞皱缩、细胞核固缩、核碎片和凋亡小体的形成。NGF治疗组中,p53则又明显低于 HIE组,说明 NGF对缺血缺氧性脑损伤导致的细胞凋亡有治疗作用。假手术组的 p53和 bcl-2属正常表达。因此本实验结果显示 NGF对缺血缺氧性脑损伤有保护作用,这与大量的文献报道一致。另外 NGF是一种大分子多肽,腹腔注射后作用于脑组织是由于新生大鼠血脑屏障发育的不完善,同时缺血缺氧进一步损伤了血脑屏障。

1 陈惠金,周建德.新生大鼠实验装置的研制 [J].上海实验动物科学,1999,19(1):45.

2 骆纯,朱诚,卢亦成,等.大鼠液压脑损伤后 bcl-2、bcl-x和Bax的蛋白表达的改变 [J].第二军医大学学报,2001,22(1):54-56.

3 刘思渝.神经生长因子及其受体在中枢神经系统修复中的作用[J].Foreign Medical Sciences Section on Neurology＆Neurosurgery,2001,28(2):112-114.

4 贺双腾.缺血性脑损伤时神经生长因子的表达 [J].国外医学-脑血管疾病分册,1998,6(1):13-16.

5 胡桦,崔尧元.脑缺血与细胞凋亡 [J].生命科学,1998,10(1):25-27.

6 Nitatori T,Sato N,Waguri S,et al.Delayed neuronal death in the CA 1 pyram idal cell layer of the gerbilhippocampus following transientischem ia is apoptosis[J].JNeurochir,1995,15:1001.

7 高东,王景周.抗细胞凋亡治疗缺血性卒中的研究进展 [J].国外医学-脑血管疾病分册,2000,8(6):349.