脑缺血再灌注损伤引起的线粒体功能障碍及丹参酮ⅡA的保护作用研究

支文煜

线粒体是生物体内能量的主要来源,因此脑缺血再灌注引起的能量障碍主要与线粒体结构功能损伤有关。线粒体既是ROS产生的主要细胞器,也是 ROS主要攻击对象。因此清除氧自由基保护线粒体功能结构完整是发挥抗脑缺血活性的关键环节[1]。

丹参为唇形科多年生草本植物,是我国传统活血化淤的中药,广泛用于心脑血管疾病的治疗,但其作用机制尚不明确。丹参酮 (Tanshinone)是丹参的有效活性组分,其中丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA,TanⅡA)为丹参酮中含量最高的活性成分[2]。本实验采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,研究丹参酮ⅡA对大鼠脑缺血再灌注损伤缺血区额顶部皮质线粒体损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物分组 健康 SD大鼠,雄性,清洁级,共 40只,体质量 (220±30)g(购自复旦大学动物实验中心)。随机分为:假手术组、缺血再灌注组、TanⅡA低剂量治疗组、中、高剂量治疗组,每组各 10只。

1.1.2 给药途径与药量 TanⅡA低剂量治疗组 (20mg/kg)和高剂量治疗组 (40mg/kg)均于术前连续灌胃给药 1周,1次/d,假手术组和缺血再灌注组给予等量的 0.9%氯化钠溶液灌胃。第 7天给药后 1h建立局灶性脑缺血 90min再灌注 24h动物模型。

1.1.3 试剂 TTC购自中国医药集团上海化学试剂公司;Rohdamin123购自 sigma公司;线粒体提取试剂盒购自海门碧云天生物工程公司。其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立 参照 Longa等[3]方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。采用颈外动脉插入线栓法,各组均进行左侧大脑中动脉栓塞。线栓采用石蜡线栓。线栓直径约0.27mm,插入深度约 18mm,此时线栓头位于大脑中动脉起始部。缺血 90min时,抽提线栓实现再灌注。神经功能缺陷评分:按照 Longa等[3]评分标准 (0分:正常,无神经学征象;1分:动物不能完全神展右前肢;2分:动物右侧肢体瘫痪,行走时向右侧转圈,出现追尾现象;3分:动物行走向右侧跌倒,或动物不能站立或动物打滚;4分:无自发活动,有意识障碍)各组分别在再灌注 24h进行评分。神经功能缺陷评分在 1～3分为模型成功。

1.2.2 缺血皮质线粒体提取 根据文献报道[4],手术动物于缺血再灌注 24h后断头取脑,迅速分离右侧大脑前额缺血皮质,称重后,置入玻璃匀浆器,按 1∶10(M/V)加入 MSETB缓冲液 (210mm mannitol,70mm sucrose,0.5mm EDTA,10mM Tris-HCl,0.2%BSA,pH7.4),手动匀浆,上下各 10次。匀浆液 2000g离心 3min后取上清 12000g再离心 10min。所得沉淀为线粒体。整个实验过程在冰面上进行。碧云天公司BCA试剂盒蛋白定量[5]。

1.2.3 线粒体呼吸功能检测[6-7]采用 Clark-氧电极进行测定,反应温度控制在 30℃。连二亚硫酸钠标定 0%和 100%氧含量。将新鲜制备的线粒体加入到反应缓冲液中 (15mm sucrose,25mm Tris-HCl,10mm KH2PO4,pH7.4),加入 5mm呼吸底物苹果酸和谷氨酸,最后加入 0.2mM ADP启动 3态呼吸。3,4态呼吸速率以及呼吸控制指数按公式计算:V=O(nmol)/t(m in)/protein(mg)RCI=V3/V4。

1.2.4 线粒体呼吸链酶复合物活性检测 反复冻融 3次破坏线粒体膜,测定温度 30℃,反应体积 1ml。具体方法如下。

1.2.4.1 复合物Ⅰ活性的测定 将线粒体与 10mm Tris-HCl(pH8.0)缓冲液、80AM 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decyl-1,4-benzoquinone(DB),1 mg/ml BSA,0.25mm KCN和 0.4AM antimycin(抗霉素 A)混合后,加入 200AM NADH启动反应。连续测定 340nm处 NADH吸收值的变化 (NADH的消光系数 E=515/mm/cm)。

1.2.4.2 呼吸链酶复合物Ⅱ活性测定 将线粒体加入到复合物Ⅱ反应缓冲液内,混匀后加入 20AM琥珀酸盐启动反应。连续测定 600nm处 2,6-dichlorophenol-indophenol(DCPIP)吸收值的变化 (DCPIP的消光系数 E=1911/mM/cm)。反应缓冲液含:50mm磷酸盐 (pH7.4)50AM DCPIP、2mm KCN、2Ag/ml rotenone(鱼藤酮)、 2Ag/ml抗霉素 A、25AM DB。

1.2.4.3 复合物Ⅲ活性的测定 将线粒体加入到复合物Ⅲ反应缓冲液内,混匀后加入 80AM还原型 DB(DBH2)启动反应。连续测定 550nm处 cytochrome c吸收值的变化 (cytochrome c的消光系数 E=19.0mm/cm)。反应缓冲液中含50mm Tris-HCl(pH7.4)、1mm EDTA、250mm蔗糖、2mm KCN、50Am氧化型 cytochrome c。

1.2.4.4 复合物Ⅳ (细胞色素氧化酶)活性的测定 将线粒体加入到复合物Ⅳ反应缓冲液内,测定 550nm处 cytochrome c吸收值变化 cytochrome c的消光系数 E=(19.0mm/cm)。缓冲液含 10mm Tris-HCl(pH7.0),25mm蔗糖、120mm KCl、0.025%n-dodecyl-β-D-malto-side、50AM还原型细胞色素 c(二硫苏糖醇还原)。

1.2.5 线粒体 ROS检测线粒体的 ROS生成量采用 H2DCFDA探针测定[8]其基本原理是,非荧光性物质 H2DCFDA能透过细胞膜进入细胞,在细胞内非特异性的内源性酯酶作用下脱去乙酰基,形成非透膜性物质 dichlorodihydmfluorescein(H2DCF),后者在 ROS的氧化作用下可生成强荧光性产物 dichloronuorescein(DCF)。测定方法:取含 40μg蛋白质的线粒体孵育于含 10μmol/L H2DCFDA的反应缓冲液中加入苹果酸和谷氨酸各 2.5mm,一起孵育60m in后以激发波长488nm,发射波长 525nm,检测 DCF生成量,以假手术荧光量为 100%。

1.2.6 线粒体肿胀度的检测 新鲜制备线粒体,反应缓冲液(250mm蔗糖、5mm KH2PO4、3mm琥珀酸钠,pH7.2)总体积 150μl,含线粒体蛋白 50μg,混匀后记录 520nm处吸光度值。

1.3 统计学方法 计数资料采用 χ2检验,以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹参酮ⅡA对缺血再灌注大鼠线粒体呼吸功能的影响脑缺血 1h再灌注 24h可明显损伤缺血区线粒体呼吸功能。与假手术组比较,脑缺血再灌注可导致线粒体呼吸功能各项指标明显改变。3态呼吸率下降,4态升高,RCI降低。而丹参酮AⅡ能够呈剂量依赖性明显改善线粒体呼吸功能,见图1。

2.2 丹参酮Ⅱ A对缺血再灌注大鼠线粒体呼吸链酶复合物的影响 脑缺血 1h再灌注 24h,可明显降低线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅳ的活性,假手术组呼吸链酶复合物 I平均活性为1.81μmol/min/mg protein,缺血再灌注组降至 0.45μmol/min/mg protein;假手术组Ⅳ平均活性为 0.29μmol/min/mg protein,缺血再灌注组降至 0.15μmol/min/mg protein丹参酮 AⅡ能呈剂量依赖性显著改善缺血再灌注所导致的线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅳ的下降。对Ⅱ、Ⅲ无显著影响,见图2。

2.3 丹参酮ⅡA对缺血再灌注大鼠线粒体 ROS的影响 手术组线粒体 ROS生成量明显高于假手术组,丹参酮 ⅡA能够显著降低线粒体 ROS。

2.4 丹参酮 AⅡ对缺血再灌注大鼠线粒体肿胀度的影响 线粒体膜肿胀导致其浊度下降,表现为 520nmOD值下降。丹参酮 AⅡ能够显著抑制脑缺血再灌注引起的 OD值降低。

图1 益母草碱对缺血再灌注大鼠线粒体呼吸功能的影响。A:V 3 3态呼吸率;B:4态呼吸率;C:RCI,呼吸控制指数Figure 1 Effect of TanⅡA on the mitochondrial respiration function of MCAO rats.A:V 3 the activity of state 3 respiration;B:the activity ofstate 4 respiration;C:RCI,respiratory control index

图2 丹参酮 ⅡA对缺血再灌注大鼠脑组织线粒体呼吸链酶的影响。A:复合物 I的活性;B:复合物Ⅱ的活性;C:复合物Ⅲ的活性;D:复合物Ⅳ的活性Figure 2 Effectof TanⅡon the enzyme activitiesofm itochondrial respiratory chain in cerebral ischemia-reperfusion ratmodel.A:activity of complexⅠ;B:activity of complexⅡ;C:activity of complexⅢ;D:activity of complexⅣ

图3 丹参酮ⅡA对缺血再灌注大鼠脑组织线粒体 ROS的影响Figure 3 Effect of TanⅡA ton ROS generation of mitochondria isolated from the ischemia cortex of MCAO rats

图4 丹参酮ⅡA对缺血再灌注大鼠脑组织线粒体肿胀度的影响Figu re 4 Effect of TanⅡon themitochondrial swelling of MCAO rats

3 讨论

大量研究表明,线粒体在缺血性卒中发病过程中发挥着重要的作用。线粒体呼吸链是由一系列氧化还原酶组成,这些酶形成四种主要的电子传递酶复合体,根据电子传递次序分为酶复合体Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ[8]。

在缺氧缺糖时,线粒体遭受氧自由基的攻击,功能结构受损,因此呼吸功能出现障碍。我们的研究发现,丹参酮ⅡA能够呈剂量依赖性地降低缺血再灌注引起 ROS的增多。

3 态呼吸率是衡量电子沿呼吸链传递给氧的指标,4态主要是传递链电子漏流所致。3态和 4态比值可反映线粒体完整情况[9]。本实验通过 Clark氧电极,观察到缺血再灌注后,缺血皮质线粒体 3态呼吸率下降,4态升高,同时氧化磷酸化效率降低,表明线粒体内膜受损,电子漏流增加。而丹参酮 AⅡ能够明显改善这一状况。

通过检测呼吸链酶复合物发现,复合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ都明显降低,但是丹参酮ⅡA只能够提高 I、IV的活性。可能是其作用靶点。

本研究认为,缺血再灌注后,线粒体大量自由基的产生,攻击线粒体,使其结构和功能破坏,酶活性丧失,因为引起呼吸功能障碍,同时膜屏障的破坏,导致大量离子内流,使线粒体肿胀,而丹参酮ⅡA可以阻断这些途径。

1 Anderson MF,Sims NR.The effects of focal ischem ia and reperfusion on the glutathione content of mitochondria from rat brain subregions[J].JNeurochem,2002,81(3):541-549.

2 胡霞敏,周密妹,胡先敏,等.丹参酮ⅡA对脑缺血再灌注大鼠脑损伤的保护作用及对能量代谢的影响 [J].中国临床药学杂志,2006,15(3):176-179.

3 Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible m iddle cerebral artery occusion without cranietomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84.

4 Sim NR.Rapid isolation of metabolically active m itochondria from rat brain and subregionsusing Percoll density gradient centrifugation[J].J Neurochem,1990,55(2):698-707.

5 Szeto HH.Mitochondria-targeted peptide antioxidants:novel neuroprotective agents[J].AAPS Journal,2006,8(3):521-531.

6 Sciamanna MA,Lee CP.Ischem isa/reperfusion-induced injury of forebrain m itochondria[J].Arch Biochem Biophys,1993,305:215-224.

7 Du G,Mouithys-Mickalad A.Generation of superoxide anion bymitochondria[J].Free Radic Bio Med,1998,25:1076-1077.

8 Lorenzo G,Eugenia M,Oliver K,et al.Targeting post-m itochondrial effectors of apoptosis for neuroprotection[J].Biophysica Acta,2009,1787:402-413.

9 Fahim Al,Seema Y.S-Allyl L-cysteine diminishes cerebral ischem ia-induced mitochondrial dysfunctions in hippocampus[J].Brain Res,2009,1265:128-137.