血源性腌肉色素研究进展

王纪霞，王瑞华，王海波，孙明胜，杨国锋，肖 贺，蔡克周，周存六*，陈从贵

(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009)

血源性腌肉色素研究进展

王纪霞，王瑞华，王海波，孙明胜，杨国锋，肖 贺，蔡克周，周存六*，陈从贵

(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009)

硝酸盐、亚硝酸盐替代物的研究一直是肉类加工行业亟待解决的技术问题。本文对血源性腌肉色素的制备原理和方法及其性质和应用等研究现状进行详细综述，指出目前腌肉色素研究存在的问题和今后努力的方向，为腌肉色素等相关研究提供借鉴。

配体；血红蛋白；腌肉色素

Abstract：It has been an urgent issue to find an alternative to nitrate and nitrite in the field of meat industry. In this paper, the preparation principle and methods, properties and applications of cured cooked-meat pigments (CCMP) are reviewed. Meanwhile,the current problems as well as further research direction are also discussed. All of these investigations will be helpful fools for the further development of CCMP.

Key words：ligand；hemoglobin；cured cooked-meat pigments (CCMP)

色泽是腌制肉品的重要品质特性，是影响消费者作出购买决定的关键因素之一。硝酸盐、亚硝酸盐是传统的腌制剂，具有呈色、呈味和抑制肉毒芽孢杆菌繁殖作用，也是目前最普遍使用的腌制剂之一。然而，亚硝酸离子能够与氨基酸分解产物胺类化合物反应形成致癌物质，其安全性受到广泛关注，硝酸盐、亚硝酸盐替代物的研究一直是肉类加工行业亟待解决的技术问题。

1 以血液为原料制备腌肉色素的理论依据

血红蛋白由中心血红素和外围珠蛋白组成，血红素由中心铁离子和卟啉环组成。肌红蛋白具有类似于血红蛋白的结构[1]。通常，铁离子呈二价，含有d层空轨道，具有接受配体提供的孤电子对、形成配位化合物的能力[2-3]。根据晶体场理论，当血红蛋白、肌红蛋白与配体配位，晶体场能降低、变得稳定[4]。这是以血液为原料制备肉制品色素的理论依据。

2 腌肉色素制备

目前，亚硝基血红蛋白(HbNO)是研究最为深入的血源性肉制品色素。Henry等[5]认为不论铁的状态是二价还是三价，NO均能够与血红素蛋白质螯合。20世纪70年代，前苏联莫斯科肉乳工艺学院的Pal'min等[6]最早提出使用腌肉色素概念，此时已有向装有肌红蛋白的试管内通入一氧化氮、直接反应制备亚硝基肌红蛋白(MbNO)的实验报道。Rubin[7]比较详细地研究了腌肉色素，他们采用牛血中的血红素与NO或NaNO2合成亚硝基亚铁血红素。Pegg等[8]利用血红素与NO合成了腌肉色素，将NO的饱和溶液逐滴加入到血红素溶液中，测定吸光度的变化曲线得知血红素与NO是1:1结合的。在我国，曹稳根等[9]依次以氢氧化钠溶液加入至血红细胞中提取血红素，向该溶液加亚硝酸钠反应、再加入胰蛋白酶分解，得到亚硝基血红色素溶液。孔保华等[10]利用猪血中的血红素与一定量的亚硝酸盐反应，经真空冷冻干燥合成制得腌肉色素。通过血红素与N O或NaNO2制备的腌肉色素遇光、尤其遇空气易褪色，在避光和无空气的条件下，色素可保持30d左右，而暴露在空气中仅能保持1d。很显然，这样的腌肉色素商业应用价值很小。为提高其保存期，采用包埋措施处理。经这种技术处理的腌肉色素，稳定性有了一定提高，但仍未解决其稳定性这一根本问题。

血红蛋白具有血红素结构单元，具备与NO配体配位的条件；其外围有珠蛋白，因此，血红蛋白比血红素更稳定。据此，张坤生[11]提出直接利用血红蛋白与NO反应制备腌肉色素，其利用鸡血制备血红蛋白、再分别与NO或NaNO2制备腌肉色素。马美湖等[12]利用NaNO2、异抗坏血钠、尼克酰胺制备HbNO。与亚硝基血红素相比，HbNO具有较高的稳定性。但这种制备方法设备投入大、操作难、需要大量有机溶剂，不适合工业化生产。NO属小分子配体，能够穿透血细胞膜。利用这个性质，解万翠等[13]以猪血细胞为原料，直接与亚硝酸钠反应制备腌肉色素。坂田亮一等[14]以商业血红蛋白粉配成溶液和亚硝酸钠、抗坏血酸钠制备腌肉色素。严聃[15]对HbNO合成进行改进，在酶的催化下有控制地酶法水解、再亚硝基化。与用纯血红蛋白合成的腌肉色素相比，该方法将蛋白质分子中的肽键有限水解切开，使血红素暴露、NO更容易且牢固地结合其上生成亚硝基血红素多肽。这种条件下的血红素仍有较长的多肽链保护，因而稳定性有了很大提高。

与亚硝基血红素相比，H bN O具有较高的稳定性，但这种腌肉色素见光易分解，需要稳定化处理。O’Boyle等[16]对HbNO微胶囊化干燥工艺进行了研究，结果表明最适的微胶囊壁材是β-环糊精、变性淀粉和麦芽糊精，其中β-环糊精是必不可少的，经微胶囊化喷雾干燥的HbNO着色剂化学性质并没有改变。邢绍平等[17]用蔗糖对HbNO进行糖基化处理、提高HbNO的稳定性。经过微胶囊化或糖基化处理的HbNO稳定性有一定程度的提高，但其稳定性仍需进一步提高。

配体与血红蛋白配位、导致晶体场能量降低，是血红蛋白稳定性提高的根本原因[4]。含有N、O、S等元素的分子具有提供孤对电子和与血红蛋白中心铁络合的能力[3]。只要这些分子穿越其外围珠蛋白并与血红蛋白接触，就有与血红蛋白络合的能力。近年来，利用其他配体与血红蛋白络合、制备腌肉色素的研究相继展开。缪岳琴等[18]以半胱氨酸为配体、与血红蛋白络合制备腌肉色素；王远明[19]选用了烟酸、烟酰胺和TEA为配体、与血红蛋白络合制备腌肉色素；杨锡洪等[20-21]利用组氨酸为配体 与血红蛋白络合、再进行糖基化处理制备新型无硝腌肉色素。钱瑞生等[22]通过CO与血红蛋白络合、制备新型腌肉色素碳氧血红蛋白。Silkstone等[23]描述了CO与肌红蛋白结合过程中的动力学和光学转化，认为血红素中铁离子结合的CO容易光解失去。Mark等[24]研究了低温下CO和O2分别与肌红蛋白和血红蛋白结合的本质。在－265℃下，光化产物形成需要4×10-11s，光催化分解要用几分钟；O2的光化产物产率是0.4±0.1，而CO与肌红蛋白和血红蛋白的光化结合产率均为1.0±0.1。

3 腌肉色素性质

3.1 腌肉色素稳定性

Shahidi[25]实验表明pH值为5.5～5.7时，HbNO在充一氧化氮气体的密封试管中能贮存几个月。陶菲[26]研究不同条件下HbNO色素的稳定性，结果表明：光照、氧化剂对腌肉色素有不良的影响，腌肉色素应尽量避光、真空保藏；Fe3+和Ca2+对色素的稳定性影响较大，其他离子的影响较小；温度、pH值对腌肉色素的影响不大。郑立红等[27]研究了光照、不同pH值、金属离子、氧化剂H2O2、还原剂L-抗坏血酸和蔗糖对HbNO的影响。在紫外光、日光灯和阳光照射下，HbNO溶液的吸光度都没有显著的变化；感官评价表明色素的颜色没有明显变化；HbNO在pH值4～8的范围内很稳定，在pH值低于4或高于8的条件下不稳定；在低浓度Na+、Mg2+、Ca2+、Al3+、Fe3+、Sn2+等金属离子存在时，HbNO在41h内无明显变化，到113h时吸光度增加，并产生微浑浊的现象；在H2O2存在下，HbNO溶液的颜色由红色变成黄色，说明HbNO已经变性；在有还原剂L-抗坏血酸存在时，HbNO比较稳定；蔗糖不会影响HbNO的色调和色度。上述研究是通过测定色素在80%丙酮溶液中的吸光度的变化实现的，但也可以根据Gamasa等[28]利用多谱线成像测定肉中色素浓度的方法，测定色素中不同形态的含量，说明色素的稳定性。肉中色素主要含有还原性肌红蛋白、氧合肌红蛋白、氧化高铁肌红蛋白3种形态，可以使用3种肌红蛋白形态色素的等吸收点(474、525、572、610nm)的比例来计算每种形态色素的浓度。与肌红蛋白的存在形式类似，血红蛋白也存在还原性血红蛋白、氧合血红蛋白和高铁血红蛋白3种形态，因此采用这种方法计算是可行的。Osawa[29]发现了一种便捷快速自动测定肉中色素的方法，该法为散射分光光度法，可以用该方法测定还原性肌红蛋白含量来评价肉的新鲜度，也可以测定肌红蛋白、血红蛋白的浓度反映色素的稳定性。王远明[19]研究了猪血与烟酸、烟酰胺和TEA为配体制备着色剂的稳定性，质量分数l%的该色素溶液置于阳光下照射3d(6月份的晴天)，着色剂含量下降了12.4%。杨锡洪等[30]利用组氨酸与血红蛋白制备无硝色素(NHP)，将它与腌肉色素(CCMP)比较，发现5d日光照射后NHP的特异性吸收峰降低了41.9%，NHP浑浊，颜色最终为浅红色；而CCMP很快变性、沉淀，说明N HP的光照稳定性明显优于CCMP。两种色素常温下避光保存，CCMP保藏12个月时，吸光度降低了22%；而通过糖基化作用的NHP，稳定性有所提高，吸光度仅降低了6%。Gomide等[31]测定了用CO处理过的猪血的颜色稳定性。研究考察了不同pH值对猪血和CO处理过的猪血颜色的影响，以猪血的色度值L*(亮度)、a*(红度)、b*(黄度)为指标评价。结果表明，在实验的每个pH值(7.40、 6.70、6.00)条件下，用CO处理过的猪血稳定性更高，颜色也会变成有吸引力的红色；a*值和b*值增加，L*没有显著变化。

3.2 腌肉色素的毒性

Stevanovic等[32]研究了牛血红细胞或氯化血红素中间体制备的腌肉色素(CCMP)、以及按照SOS/um实验(即环境诱变物的短期筛选实验)和Ames测试法(污染物致突变性实验)测定分别由CCMP和亚硝酸盐着色的火腿的毒性。结果表明，SOS/umu法检测中，CCMP、使用CCMP或亚硝酸盐分别着色的火腿均没有毒性。在Ames检测中，使用鼠伤寒沙门氏菌菌株TA98和TA100分别检测CCMP和亚硝酸盐着色的火腿。在亚硝酸盐着色的火腿中，只有当菌株没有新陈代谢的时候TA100菌株会显示出微弱的突变，而CCMP着色的火腿中的菌株没有突变。与亚硝酸盐着色的火腿相比，使用CCMP着色的火腿、残余量显著降低，因而安全性提高了。

3.3 腌肉色素的其他性质

张坤生等[33]用0.04mol/L的碳酸钠溶液和纯蒸馏水作溶剂，选择超声波、均质、磁力搅拌等方式，通过测定重力沉降后残渣干燥后的质量比较色素的溶解性，结果表明：0.04mol/L的碳酸钠溶液中用磁力搅拌色素的溶解性最好，溶解度达96.6%。施春权等[34]研究了pH值、NaCl浓度以及温度对HbNO起泡性和持水性的影响，结果表明，HbNO溶液的起泡性与其溶解度有关。在pH5时，即HbNO的等电点处，HbNO溶液具有最低的起泡性；偏离等电点时，起泡性由于溶解度的增加而增大，泡沫稳定性也相应提高。由于有盐溶作用，低浓度的NaCl溶液使HbNO的起泡性增大，高浓度的NaCl溶液会使HbNO盐析出来而造成其溶解度下降，起泡性降低；温度对起泡性也有促进作用，但随着温度的升高，泡沫稳定性降低；pH值、NaCl浓度以及温度对HbNO持水性的影响与起泡性一致。施春权等[35]研究了pH值、NaCl浓度以及温度对溶解性和乳化性的影响。结果表明，HbNO溶液在pH5处具有最低的溶解性，pH值越大溶解性越强；当温度低于60℃时，溶解度随温度的升高而增大，当温度高于60℃低于80℃时，溶解度轻微下降但不显著。当NaCl浓度低于0.4mol/L时，即离子强度低于1.0时，溶解度随NaCl浓度的升高而增大。当NaCl浓度高于0.4mol/L时，溶解度随NaCl浓度的升高而降低。当温度与浓度分别为60℃、0.4mol/L时蛋白的乳化活性和乳化稳定性最高，温度和NaCl浓度的升高和降低都可以降低HbNO的乳化性与乳化稳定性。

4 腌肉色素应用

Oliver等[36]将猪血血红素加入到PSE(苍白、柔软、多汁)的肉中、再制成火腿，研究了色素对火腿颜色、颜色稳定性和质构的影响。结果表明，色素使火腿的L*值降低，a*值增加，从视觉上发现火腿变红了，色素对颜色稳定性和火腿质构没有影响。

Sheridan等[37]采用两种方法测定了火腿切块后的颜色变化，一种是CIE法，用L*、a*、b*等参数表达肉的色泽，其重现性较差；另一种是分析变化中肉的颜色的反射光谱，能够清楚的表明火腿褪色的不同阶段。由血液制备的色素本身颜色比较深，加入到火腿中颜色变化程度不容易区分，适合使用反射光谱方法来测定。

Hornsey等[38]将制备的亚硝基血红素色素加入到火腿中着色，然后用80%的丙酮溶液将火腿中的色素提取出来，测定紫外吸收光谱。将火腿光照24h后，再用相同的方法提取色素、并测定紫外吸收光谱。比较两次提取色素的紫外光谱的变化，说明亚硝基血红素色素改变并稳定火腿中的色素成分，从而达到火腿的着色和色泽稳定的效果。

马美湖等[39]将HbNO作为发色剂加入到火腿中，其颜色为玫瑰红色。HbNO色素中的残留量低至7.05mg/kg。文中提到在加工火腿过程中，必须注意HbNO粉的添加程序，否则会影响HbNO在产品中的溶解性，使产品表面出现不溶性的黑色粒状斑点。郑立红等[40]将HbNO分别应用于猪肉灌肠和鸡肉灌肠中，以色度值和感官评价作为应用效果的评价标准。结果表明，以HbNO作为着色剂制成的火腿肠，感官状态接近于亚硝酸钠的发色效果，并且比红曲色素的着色效果要好。HbNO有很强的耐热性，可以使用到高温香肠中。HbNO在猪肉肠和鸡肉肠中的着色效果均良好。黄群等[41]将HbNO加入灌肠中着色，以发色率作为评价指标，得出了HbNO、抗坏血酸、烟酰胺用量的较佳组合。结果表明，加HbNO着色的产品与亚硝酸钠发色的产品感官上无明显差别。蒋云升等[42]将猪血制备的HbNO加入到香肠中，同时添加了产香发酵菌和天然抗氧化剂。结果表明，发酵菌能降解，从而降低的残留量。但是这并不能说明肉毒梭状杆菌也受到抑制而减少肉毒毒素的产生，不能消除肉毒毒素中毒隐患。施春权等[43]将猪血制备的HbNO与防腐剂复合加入到哈尔滨红肠中，研究了HbNO对产品颜色、pH值、硫代巴比妥酸反应物值(TBARS)、菌落总数等方面的影响。结果表明：HbNO能够增加红肠的红度值a*，降低TBARS值和菌落总数。未加防腐剂，只加HbNO的红肠的菌落总数也有所降低，说明HbNO除了着色功能外也有抑菌作用。邢绍平等[17]研究了食盐、葡萄糖和蔗糖等加工灌肠时常用辅料对HbNO稳定性的影响，结果表明食盐和蔗糖对HbNO的稳定性没有不良影响，葡萄糖对其稳定性有增强的作用。这可能是由于葡萄糖有较强的还原性，对HbNO有保护作用。另外，L-抗坏血酸和L-抗坏血酸钠具有很强的还原性，是肉制品中常用的发色剂及发色助剂。尼克酰胺(又称烟酰胺)可以与肌红蛋白结合形成稳定的烟酰胺肌红蛋白，难于被氧化，可防止肌红蛋白在与HbNO接触过程中被氧化变色，有利于增强HbNO的发色效果。因此建议在HbNO发色的同时加入L-抗坏血酸或L-抗坏血酸钠与尼克酰胺的复合物以增强发色效果。

5 结 论

HbNO作为着色剂可使肉制品呈现良好色泽，与添加亚硝酸钠的香肠相比、其他感官品质无明显差别；但是，至今为止，没有明显研究证据表明HbNO能够显著抑制肉毒梭状杆菌的繁殖，HbNO对光敏感、不够稳定。因此，以HbNO为色素添加到香肠中发色是可行的，色素的稳定、及其如何抑制肉毒芽孢杆菌等问题仍然需要进一步解决。另外，利用其他小分子配体与血红蛋白络合制备肉制品色素，提高色素本身稳定性、安全性也将是今后肉制品色素的一个研究方向。

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Research Progress in Cured Cooked-meat Pigments Derived from Blood

WANG Ji-xia，WANG Rui-hua，WANG Hai-bo，SUN Ming-sheng，YANG Guo-feng，XIAO He，CAI Ke-zhou，ZHOU Cun-liu*，CHEN Cong-gui
(School of Biology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

TS251.5

A

1002-6630(2010)19-0449-04

2010-06-24

国家大学生创新性实验计划项目(091035951)；合肥工业大学大学生创新性实验计划项目(2009cxsy207)；科技部科技人员服务企业行动计划项目(2009GJC30045)；安徽省科技攻关项目(08010301080)

王纪霞(1984—)，女，硕士研究生，研究方向为肉制品加工与品质控制。E-mail：chunfengfeiyang22@163.com*通信作者：周存六(1970—)，男，副教授，博士，研究方向为食品化学。E-mail：zhouc14@hfut.edu.cn