脂肪源干细胞的特性及其在骨科组织修复中的应用

黄德清,冯燕茹

(天津市第三医院骨科,天津 300250)

多年来,对于成体干细胞的研究多集中在骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BSCs)。但骨髓来源有限,抽取时有一定的并发症,所得干细胞数量少[1,2]。近年来,脂肪组织来源的干细胞(adipose tissue derived mesenchymal stem cells,ASCs)引起了人们越来越多的关注。ASCs是一种中胚层来源的细胞,最早从抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中分离培养,并证实为多能干细胞;在适当的诱导条件下能向软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞、神经细胞以及上皮细胞等定向分化,因而,其在骨科组织修复中的作用日益受到人们的重视 ,相关研究日见增多[2～4]。

1 脂肪干细胞的分离及培养

ASC的培养和分化方法均借鉴了以往 BSC的研究方法。通常采用经典培养液加 10%～20%的胎牛血清对 ASC进行培养扩增[2～4]。常用的方法是将剪碎的脂肪组织消化离心,倾去上层脂肪及上清,获得基质血管层,将其收集到培养瓶中培养,除去未贴壁的红细胞和残渣,贴壁的细胞生长至融合后传代,传代后的细胞称为 ASCs。刚贴壁的 ASCs呈圆形、纺锤形或梭形,细胞核居中,可出现双核或多核。传代后圆球形细胞减少,大部分为纺锤形或梭形。随着传代次数增加,细胞形态、排列趋于一致。在分化能力上,ASCs可以分化成各种中胚层来源的细胞系,如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、神经细胞及内皮细胞等,而这些细胞系也正是BSCs的分化方向[2,5]。

2 脂肪干细胞特征性表面标记物的表达

ASCs在形态上与 BSCs相似,因此无法从形态学上对两者加以鉴别。同时,ASC与 BSC还具有相似的分化表型[2,3,5]。有文献分析比较了 BSC与 ASC的表面标记物,发现两种细胞均能够表达 CD29、CD44、CD105、CD49b和CD49e,均不能够表达 CD31、CD34、CD45、HLA-DR和CD133;但二者在表型上也有差别,ASC表达 CD49 d,肯定不表达 CD106,而 BSC正相反,肯定表达 CD106,而不表达CD49 d。研究发现,细胞存在的微环境及细胞具体功能会影响其免疫表型的表达,如 CD106在 BSC和造血干细胞的相互作用中起重要作用,而 ASCs中 CD106的阴性表达则与其处于非造血组织的特点相一致[2,3]。

3 脂肪干细胞在骨科组织修复中的应用

3.1 促进软骨修复 ASC在成软骨培养基(chondrogenic medium,CM)中可以定向分化为软骨细胞[6～9]。CM中通常添加转化生长因子-β、地塞米松和抗坏血酸。成软骨分化成功的标志是典型基因的表达和软骨细胞外基质蛋白的出现,如 Sox-9、Ⅱ型胶原、可聚蛋白多糖、双糖链蛋白多糖、核心蛋白聚糖、硫酸软骨素和软骨低聚基质蛋白。 Winter等[8]用CM同时培养 ASCs和 BSCs,结果表明两者都能向软骨方向分化,阿尔新兰染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性,但培养 2周以后发现 ASCs不如 BSCs分化的完全。有学者将ASCs进行高密度培养,用 CM诱导后植入纤维蛋白胶支架,用其修复软骨缺损,组织学检查结果表明再生组织为透明软骨。另一项研究在小鼠体内制备骨、软骨缺损的模型,并植入ASCs进行修复,结果骨、软骨缺损均成功修复,并且 ASC修复的骨、软骨缺损的效果优于自体骨、软骨移植,而且在每个随访检查点,ASCs植入组的软骨修复参数 Pineda评分都高于自体软骨移植[2]。

3.2 促进骨骼修复 用于诱导成骨分化的培养基中添加有维生素 C、地塞米松、β-磷酸甘油,这些化学物质被认为是诱导干细胞向成骨细胞分化的定向诱导基,被称为成骨培养基(osteogenic medium,OM)[10～12]。 ASCs在 OM中诱导后可出现成骨分化,可见磷酸钙矿化的细胞外基质、骨钙素、碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原和成骨转录因子基因,如 Runx2和 OSX的表达。ASCs在 OM中体外诱导培养后第 7天,这些细胞开始分泌出岛状的细胞外基质;2周后碱性磷酸酶染色阳性并形成矿化结节;第 2～4周,培养孔中钙化的细胞外基质的量明显增加。 ASCs向成骨细胞分化的能力可以维持相当长的时间,其表达碱性磷酸酶的活性可达培养后的175 d。将小鼠 ASC在 OM中培养几代后,细胞表面形成突起,形态类似于体内的成骨细胞,茜素红染色呈阳性。研究人员进一步将此种诱导所得的小鼠 ASC作为种子细胞植入聚羟基乙酸支架中,再移植到小鼠体内,经过 4～8周时间,通过免疫组化分析,可以观察到植入部位成骨过程的发生。经成骨诱导的 ASC植入聚乳酸支架修复大鼠颅骨缺损,与对照组相比,有更多的骨组织形成[11]。研究发现,转染骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BM P-2)基因的ASCs更易分化成成骨细胞,并可更快启动细胞外基质的钙化。在大鼠体内制作后外侧脊柱融合模型,将 BM P-2转染后的 ASCs植入Ⅰ型胶原支架上,再移植到大鼠脊柱需融合部位,成功实现了脊柱融合[12]。有学者在临床上用自体 ASC与髂骨及纤维蛋白胶等结合,修复 1例 7岁女孩的大面积颅骨缺损,术后 3个月,CT扫描显示原颅骨缺损基本愈合。说明临床上使用自体 ASC是安全的,而且能促进大面积、难治性骨缺损的修复[13]。

3.3 促进椎间盘修复 因为椎间盘源性下腰痛发病率高,用干细胞修复退变的椎间盘引起了人们很大的兴趣[14,15]。有作者将兔腹股沟部来源的 ASCs单独与椎间盘髓核或纤维环共同培养,结果表明,与其他培养条件相比,与髓核一起培养的 ASCsⅡ型胶原和核心蛋白聚糖基因表达增加。这表明髓核细胞释放的可溶性因子可引导 ASCs向髓核样细胞分化。自体 ASCs无论用生长因子诱导,以及黏附于基质材料上与否,注射入椎间盘组织后,均显示其有促进椎间盘组织修复的作用。有作者将 ASC在体外用绿色荧光基因转染后,植入大鼠的腰椎间隙内,用无损伤活体成像系统成功检测到荧光基因的表达,术后 7d时表达达高峰,14 d后开始减弱,ASCs在椎间隙内存活达 28d以上[15]。

3.4 促进肌腱修复 ASCs在适当的条件下可分化为肌腱细胞,植入肌腱损伤处可明显促进肌腱愈合[2,16,17]。有作者用胶原酶制作马的肌腱损伤模型,然后在肌腱损伤周围注入自体 ASCs治疗,ASCs治疗肌腱组的生物力学测试及组织学检查结果均优于对照组,软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COM P)基因表达增加。COM P结合到复合胶原纤维上,可促进胶原的形成和成熟[16]。 Huang等[17]将 ASCs用携带绿色荧光基因的腺病毒转染后,植入大鼠跟腱缺损处,术后 0～28 d用活体无损伤成像系统在跟腱修复处检测到绿色荧光的表达;术后 28 d,修复段跟腱标本的冰冻切片用免疫荧光标记的第二抗体进行染色,荧光显微镜下,在肌腱修复段检测到大量荧光标记的 ASCs,表明ASCs可用于肌腱损伤的修复。

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