水稻矮秆基因定位和克隆的研究进展

詹庆才,肖子发

（1.中南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙 410125；2.湖南省水稻研究所生物技术研究室，湖南 长沙 41025）

1 水稻矮秆性状的研究现状

水稻诸多性状中，矮秆是研究最早和最多的性状之一，水稻的半矮秆化也是育种最重要的成果之一。20世纪60年代起全世界范围内以作物矮化育种为标记的“绿色革命”使作物的产量得到了大幅度的提高。

1.1 水稻矮秆性状的遗传研究

从广义上讲，水稻的矮生性是指成熟期水稻株高比正常植株缩短的遗传特性。经典遗传学表明水稻株高既属于数量性状，又表现为质量性状遗传。在籼稻中，矮秆遗传主要受1个隐性半矮秆基因控制（sd1），遗传力较高，与高秆品种杂交后代呈高秆和矮秆的双峰分布，并且大多数半矮秆籼稻品种的半矮秆基因均为sd1的复等位基因。在粳稻中，矮秆遗传与籼稻相似，但根据控制矮秆的基因对数可以将粳稻矮秆品种分为两类，一类由单个矮秆主效基因控制，另一类由多个矮秆微效基因控制，而且控制粳稻矮秆的主效基因一般为非等位关系[1-2]。

20世纪末，随着分子生物学的发展，利用分子标记对控制水稻株高性状进行QTL检测，将对水稻矮秆性状遗传研究从经典遗传学的水平深入到分子水平，为最终阐明水稻矮秆的遗传机制奠定了基础[3]。1986年日本的水稻基因符号、命名和连锁群委员会将矮秆基因统一定名。具有强矮化效应、植株表现为矮秆（狭义）类型的基因定名为d系统，而具有较弱矮化效应、植株表现为半矮秆类型的基因定名为sd系统，根据被鉴定的时间顺序，从1往后排[4]。目前，已分别注册到d-62和sd-8，其中部分矮秆（半矮秆）基因是相同的或等位的；例如，d-6和d-34，d-10、d-15和16，d-11和d-8，d-12和d-50，d-14和d-10，sd-1和d47分别是等位的。

1.2 水稻植株矮化机制研究

水稻植株矮化是矮秆主基因表达作用的结果，同时也受到修饰基因或抑制基因的影响[5]。一般认为矮秆基因的作用能直接导致水稻植株形态学或细胞学的变化，如节间变短和细胞个数减少，从而使植株变矮；同时，基因的表达还受到外部环境和内源条件的影响。

1.2.1 水稻植株矮化与节间或细胞长度、数目的关系20世纪80年代前，有关水稻矮秆机理的研究主要集中在外部形态。由于细胞的生长和功能决定植株器官的结构和功能，分析水稻植株的矮化机理有必要进行细胞学的研究。Kamijima等[6]通过对许多等基因矮秆系的研究，发现节间长度与细胞数目呈高度正相关，而与细胞长度无显著相关性，表明节间的缩短可能是细胞数目减少的结果。

1.2.2 水稻植株矮化与温度的关系部分矮秆基因对水稻植株的矮秆作用与温度存在相互作用。此外，携带矮秆基因d58的植株在低温条件下生长时表现矮秆小粒，在高温条件下则表现正常[7]。

1.2.3 水稻植株矮化与植物激素的关系水稻的生长和发育主要受到六类植物激素的调节，它们分别是生长素（Auxin），赤霉素（GA）、细胞分裂素（Cytokinin）、脱落酸（ABA），乙烯（Ethylene）和油菜素幽醇（BRs）。6种激素中，GA与植物株高性状关系最密切[8]。目前已克隆的矮秆基因有Sd1和D18，分别编码赤霉素合成途径中的关键酶GA20-氧化酶和GA3-氧化酶[9]。如d1突变体，目前d1基因已经克隆，它编码一个G蛋白α亚基，参与了GA的信号传导[10]。

近年来的研究表明水稻矮化也与BR的合成及其信号传导受阻有关。在拟南芥中已经克隆到5个与BR合成相关的基因（Dim，Cpd，Dwarf1，Dwar4和Dwarf7）以及2个与BR传导相关的基因Bri1和Bri2分别编码一个富含亮氨酸的蛋白激酶以及一个GSK3/SHAGGY类似的激酶[11-12]。在水稻中也克隆到了2个与BR合成相关的基因OsBR6ox和D2以及1个与BR传导相关的基因Osbri1[13-14]。

1.3 水稻矮化材料的利用研究

中国籼型矮源在全球籼稻矮化育种中起到了启动和关键作用。除中国大陆外，低脚乌尖几乎是所有矮化品种的共同祖先。粳稻的矮生性以日本最早开始研究，主要矮源有农林8号、农林1号、农垦58、藤坂5号、石狩白毛和金南风；意大利品种巴利拉（Balilla）也是粳稻育种的主要亲本。在水稻中己鉴定了d1至d61共55个矮秆基因，但只有“d47”（即sd1）在水稻育种中发挥了作用。同一矮秆基因的广泛利用潜藏着由遗传单一带来的风险。因而发掘、鉴定和利用新矮源应成为当今水稻育种中的重要研究内容[15]。

2 水稻基因精细定位与克隆

随着拟南芥和水稻基因组的测序完成，一个重要的目标就是鉴定和克隆在农艺生产上有价值的基因。目前主要的策略是采用图位克隆法以及利用突变体和生物信息学。

2.1 图位克隆的原理

克隆基因最经典的方法就是图位克隆法。图位克隆法主要包括4个基本技术环节:目的基因的初步定位；精细定位；目的基因所在区域物理图谱的构建；筛选cDNA文库或基因组文库并进行功能互补实验。其中目的基因的精细定位是图位克隆策略中最艰苦和最耗时的限速步骤。利用混合样品作图可以有效地提高精细定位的效率[16]。

2.2 图位克隆的应用

随着水稻高精密遗传图谱和物理图谱的相继构建成功[17]，尤其是全基因组测序结果的公布[18]，为水稻基因的精细定位以及后续的图位克隆创造了优越的条件。早期在水稻中克隆的两个抗白叶枯病基因和两个抗稻瘟病基因均是利用图位克隆战略完成的[19-20]。最近报道的一些水稻基因的图位克隆则是以突变体为材料，如矮秆基因d1、d2、单分蘖基因Moc1和脆秆基因BC1[21]。Ashikari等[10]从13000个F2植株中选取了3185个矮秆植株，应用RFLP和STS等分子标记将d1基因定位于0.15 cM的小区域内，并应用EST最终克隆d1基因。

以QTL为起点的图位克隆则相对于主基因的克隆更为困难一些，主要是由于QTL的效应一般都较小又受基因组背景的调节，且易受环境的影响。1996年Alpert和Tanksley首次在番茄中克隆了控制果重的QTL[22]。迄今，最为成功的例子莫过于日本研究人员对一系列水稻抽穗基因的克隆:Hd1、Hd3a和Hd6[23]。

2.3 生物信息学的应用

随着拟南芥和水稻基因组的测序完成以及数据的释放，生物信息学越来越凸现出其重要性。当目的基因精细定位到一定小的区域时，候选基因的确定就非常关键了。应用生物信息学可以快速、省时和准确地确定目的基因。Li等[24]将单分孽基因Moc1精细定位到约20 kb的小区间，通过基因注释，发现在20 kb的小区间里有一个编码蛋白与番茄的Lateral Supperssor（LS）蛋白高度同源。

对QTL的克隆同样依赖于生物信息学。在QTL精细定位甚至是初步定位的基础上，利用生物信息学提取众多的预测基因，并通过对性状及生理生化等的分析，从而可以确定候选基因，最终克隆基因。Ishimaru等[25]就利用日本晴及其一个近等基因系NIL-6，在QTL初步定位的基础上分离和鉴定了一个控制株高的基因，位于第1染色体长臂上的一个淀粉合成相关基因:蔗糖磷酸合酶（SPS）。

2.4 突变体资源的应用

2.4.1 T-DNA直接插入法T-DNA利用其转移特性插入到植物基因组中。T-DNA插在基因组不同的部位造成各种插入结果。由于多数突变性状是由隐性基因决定的，因此一旦确定了突变性状和T-DNA是连锁的，就可以通过获得旁邻序列，从而得到被标签的功能基因。

2.4.2 转座子系统插入法由于转座子的特殊特性（它的插入会引起基因突变，而当它割离之后基因的功能又可以恢复），可以将它作为一个插入突变原，用来克隆因为转座子插入而失活的基因。

2.4.3 逆座子标签法逆转座子被认为与基因的复制和基因的表达调控相关。当植物染病、创伤或是在组织培养时都会发生逆转座子的转座。

2.4.4 增强标签法因为正常情况下基因产物的数量是限定的，必须与其他产物达到平衡。基因产物的不足或过量都会破坏这种平衡，并表现出生长与发育的异常。该标签系统在T-DNA的右边界附近加入多个串联的启动子，促使细胞中某一基因过量表达。

根据突变体的表型，利用生物信息学可以查找拟南芥以及其它禾本科作物中已经克隆到的基因，通过序列的比对，在水稻中找到一些同源基因，继而进行基因的克隆与功能研究。最新报道的一些水稻基因就是通过这种策略完成的，如d18、Osbri1和OsBR6ox[26]。Mori等[14]获得一个单隐性矮秆突变体后，通过表型的观察、外源激素的处理以及内源激素含量的测定，发现矮秆是由于BR合成的一个关键酶BR-6-氧化酶缺失引起的，通过数据库的查找，发现了一个与番茄中编码BR-6-氧化酶的Dwarf基因以及拟南芥BR6ox基因同源的EST，野生型和T2代突变体DNA序列的测定验证了缺失和插入引起了移码并造成了的OsBR6ox的功能缺失。

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