正交试验法优选祖师麻熏洗液醇提取工艺

敖利

（重庆市中医研究院，重庆 400013）

祖师麻熏洗液是由祖师麻、乳香、没药等14味中药组成的中药复方制剂，具有祛瘀止痛、祛风除湿的功效，临床上用于治疗退行性骨关节病。根据处方中药材所含有效成分的性质，分别需要提取挥发油，或用水提取，或用乙醇提取，其中祖师麻、乳香、没药采用乙醇回流提取。笔者通过正交试验筛选，以祖师麻所含的主有效成分之一祖师麻甲素含量为考察指标，用方差分析法进行分析，优选了祖师麻熏洗液乙醇提取工艺条件[1－2]。

1 仪器与试药

UV－752型紫外分光光度仪（上海电子光学技术研究所）；HNS11－2型电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械厂）；AZ－200型电子天平（天津Mettler公司）；PBQ－Ⅰ型薄层自动铺板仪（重庆南岸新力实验电器厂）；微量进样器（上海医用激光设备厂）；KQ－250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TGL－16G型台式高速离心机（上海医用分析仪器厂）。薄层层析硅胶G（60型，中国青岛海洋化工集团公司）；祖师麻甲素对照品（瑞香素，批号为0900－200102，中国药品生物制品检定所）；药材购自重庆市药材公司；祖师麻、乳香、没药乙醇提取样品（自制）；所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 祖师麻甲素含量测定

2.1.1 对照品溶液制备

精密称取在105℃干燥至恒重的祖师麻甲素对照品10.4mg，置10mL量瓶中，用95％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得（质量浓度为1.04mg/mL）。

2.1.2 方法学考察

标准曲线制备：精密吸取祖师麻甲素对照品溶液10，20，30，40，50μL，分别置10mL量瓶中，各加95％乙醇－0.1moL/L盐酸（10∶1）至10mL刻度，于328 nm波长处测吸光度（A）。经计算，回归方程为 A=0.000 3+0.046 9C，r=0.999 95（n=5）。结果表明祖师麻甲素质量浓度在1.04～5.20mg/mL范围内与吸光度的线性关系良好。

稳定性试验：取祖师麻醇提工艺样品溶液20μL，祖师麻甲素对照品溶液10μL，点于硅胶G板上，以甲苯－甲酸乙酯－甲酸（5∶4∶1）为展开剂，上行展开15 cm，显色，定位，挖取祖师麻甲素斑点及空白斑点，加95％乙醇－0.1mol/L盐酸（10∶1）超声波洗脱10min/次× 4次，60℃水温，每次离心1min（10 000 r/min），合并上清液，定容至10mL。于328 nm波长处测定吸光度，每隔一段时间测定1次，共测定24h。结果表明在本试验条件下，祖师麻甲素在8h内稳定。

精密度试验：依法在同一硅胶G板上点5等量的同一供试品溶液，同时点对照品溶液10μL，依法操作，测定吸光度。结果的RSD=0.19％（n=5），表明方法精密度良好。

重现性试验：依法对同一批样品进行5次独立测定。先薄层展开，定位，挖取斑点，洗脱4次，10min/次，60℃水温，离心，取上清液，定容至10mL，进行测定。结果的 RSD=1.69％（n=5）。

加样回收试验：取祖师麻醇提工艺样品溶液6份，每份4mL，分别精密加入一定量的祖师麻甲素对照品，混匀。每份取20μL点样，薄层展开，定位，挖取斑点，用95％乙醇－0.1mol/L盐酸洗脱4次，10min/次（60℃水温），离心1min（10 000 r/min），取上清液，定容至10mL，测定吸光度，计算回收率。结果见表1。

2.1.3 样品含量测定

取各工艺样品溶液，各点20μL于硅胶G－3‰ CMC－Na（0.4mm）薄层板上，以甲苯－甲酸乙酯－甲酸（5∶4∶1）为展开剂，上行展开15 cm，取出晾干，以氨气显色定位。待挥尽氨气后，挖取祖师麻甲素斑点及空白，粉末装入小试管中，各加1 mL 95％乙醇－0.1mol/L盐酸（10∶1），超声洗脱10min（60℃水浴），离心1min（10 000 r/min），上清液倒入10mL量瓶中。共洗脱4次，合并洗脱液，并定容至10mL，于328 nm波长处测定吸光度，计算祖师麻甲素含量。

表1 加样回收试验结果（n=6）

2.2 工艺参数优化

2.2.1 正交试验设计及因素水平选择

祖师麻、乳香、没药采用乙醇回流提取，影响提取效果的主要因素有乙醇浓度（因素A）、乙醇用量（因素B）、提取时间（因素C）、提取次数（因素D），每个因素取3个水平，应用L9（34）正交表安排正交试验，以祖师麻甲素含量为考察指标。按处方比例取祖师麻30 g、乳香10 g、没药10 g，按正交试验号提取，药液滤过，测定含量。正交试验因素水平表及结果见表2及表3。

表2 因素水平表

表3 正交试验结果表

2.2.2 数据分析

方差分析见表4。由直观分析可知，因素D的极差 R最大，是最有影响的因素，各因素选择为A3B3C3D3。由方差分析可知，各因素对乙醇回流提取结果有不同程度影响，D＞A＞B＞C。因素D有显著性差异，为主要影响因素，应选D3。C因素影响最小。综合考虑，各因素选择为A1B2C1D3，即加4倍量50％乙醇，每次回流提取1h，共提取3次。

表4 方差分析表

2.2.3 验证试验

由于优选的工艺未包括在正交设计表的9项试验中，故对其进行验证试验。用同一批药材，提取同样质量，分别按A3B3C3D3与A1B2C1D3进行试验。结果A3B3C3D3与A1B2C1D3所提得的祖师麻甲素含量分别是0.56％和0.55％，非常相近，从省时节能角度考虑，确定A1B2C1D3为乙醇提取最佳工艺，即加4倍量50％乙醇，回流提取1.0h，共提取3次。

3 讨论

方中祖师麻、乳香、没药含有较多脂溶性成分，采用乙醇回流提取。祖师麻的主要有效成分有祖师麻甲素（瑞香素，Daphnetin，7， 8－二羟基香豆素）、祖师麻乙素（瑞香苷，Daphenin.7，8－二羟基香豆素－7－β－D－葡萄糖苷）、皂苷等。祖师麻甲素具有消炎、镇静、镇痛作用，是祖师麻止痛、抗风湿的有效成分之一。乳香、没药含较多树脂、树胶等，若采用水煎煮，汤液会浑浊，采用乙醇提取，可增强疗效[3－4]。

本试验中因素A、因素B、因素C均未显示显著性差异，但极差分析仍能反映其影响，说明本试验所选择的因素具有一定的合理性。

[1]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，1986：1 739.

[2]谢秀琼.中药新制剂开发与应用[M].北京：人民卫生出版社，2004：136.

[3]管玉珠.祖师麻中瑞香素提取工艺比较[J].兰州医学院学报，2000，26（2）：9.

[4]崔秀君.产舒康颗粒提取工艺研究[J].中国药业，2004，13（11）：47－48.