影响肾穿刺活检六胺银染色的因素

黎家华

三峡大学医学院(湖北宜昌 443002)

肾穿刺活检已普遍应用于肾小球肾炎的分类和诊断,所采取的小块活检,一般采用六胺银染色法,以便清楚地显示肾小球基底膜的改变。基底膜是由Ⅳ型胶原蛋白、蛋白多糖和层粘连蛋白等组成,经过氧化剂处理后,能使肾小球基底膜上的糖类及有关物质中的 1,2-2二醇转变为醛,暴露更多的醛基,醛与银离子发生银镜反应,能较好的显示肾小球毛细血管基底膜的情况。在日常作肾组织六胺银染色的过程中,常会受较多不确定因素的影响,如果处理不当,将直接影响到染色效果,造成病理诊断困难[1,2]。

笔者就影响肾穿刺活检六胺银染色的因素作一简述。

1 组织固定不良对染色的影响

肾穿刺取得的活检标本,固定不及时,组织产生自溶;或取材后没有及时处理,放置过久组织干涸;固定时间短,固定不良等,都会导致结构破坏,染色质量欠佳,不能进行正确的诊断。因此,组织固定的好坏是制片的关键。新取出的活检标本放在纱布上用生理盐水将血冲洗干净,立即放进固定液内进行固定。

2 包埋、切片对染色的影响

由于肾穿刺获得的肾组织比较细小,固定、包埋时若没有放平整,易出现弯曲,不能切取最大切面,导致肾小球数目减少或没有;切片过厚会使六胺银染色过深,导致细胞增生、基底膜增厚的假象,不利于观察诊断,并且在高温染色过程中容易脱片,因此;为保证切片完整及切取最大切面,肾穿刺的组织在固定、包埋时,应保证其平整性。为切取最大切面完整的切片提供保障。要求切片厚度应≤3 μ m,且无皱折及刀痕为宜,才能有效的控制六胺银染色的深浅,比较清晰地显示基底膜的形态结构。

为防止在染色过程脱片,载玻片应进行放脱片处理,我们采用的方法是:载玻片经洗衣粉擦洗,清水冲洗干净,泡清洁液 24h,清水冲洗,蒸馏水洗净.烘干,涂 APES(防脱片剂,用丙酮 1∶50稀释,将洗净载玻片放入其中 30s拿出,蒸馏水洗)晾干备用,捞片时一步到位,在 60℃温箱考 2～4h,使切片组织充分的粘附在载玻片上。效果爽佳,没有再出现脱片现象。

3 脱蜡不够彻底对染色的影响

脱蜡时间太短;脱蜡剂(二甲苯)使用时间较长,溶蜡达到饱和时,则脱蜡能力下降或丧失;在冬天室温低,脱蜡剂的脱蜡效果差,脱蜡不彻底,组织上有残余的石蜡,用 0.5%高碘酸氧化处理时,不能对肾小球毛细血管基膜进行有效的氧化,直接妨碍六胺银染色。此时:应及时更换新的脱蜡剂。若因室温低而脱蜡效果不满意时,我们采取的措施是:置于 37℃温箱内脱蜡、延长脱蜡时间和增加一次脱蜡(30min×3次),能达到较好的脱蜡效果。

4 氧化剂浓度及处理时间对染色的影响

高碘酸处理切片时的浓度和时间的不同,导致着色深浅不一。浓度偏低、处理时间短,对肾小球毛细血管基膜氧化作用不足,着色比较浅或根本不着色,往往需要延长六胺银染色时间,浓度高、处理时间长,则易导致氧化过度,着色很深,造成基膜增厚变粗的假象,不能正确显示其病理改变,还易形成黑色反光膜,给观察诊断造成困难。氧化剂经长期反复使用,其氧化功能也会逐渐减弱,则需要更换新的氧化剂。因此:保持氧化剂足够的浓度和处理时间,是做好基底膜染色的前提。通过做预实验:设计不同的浓度和不同的处理时间,反复做几次,再根据染色结果确定适合本实验室的染色方案。有文献报道[1,2]:采用双重氧化,即先用 1%高碘酸 10min,再用 5%铬酸 20～40min,能充分暴露更多的醛基,加强基底膜着色。

5 六胺银染色的时间和温度对染色的影响

六胺银染色的时间的长短受染液的新鲜度、温度高低等因素的影响,染色时间过短,染色反应不足,基底膜着色浅,肾小球基底膜不能清晰显示出来;染色时间过长,染色反应过度,基底膜着色很深,组织切片表面还会出现的银镜反应所形成的黑色反光膜,切片背景显得很脏,影响对比染色。

温度的高低,决定染色结果的是否成功,温度低于 60℃,组织的反应缓慢,浸染时间长,易出现的黑色沉淀,氯化金调色时无法清除,温度更低,则几乎不反应,温度过高(高于 70℃)溶液易加速氧化反应而变混浊,组织的反应快,易过染,难以控制,不利于观察病变。

选择合适染色的温度是六胺银染色成功的关键,有专家采用微波快速预热的方法、温度控制在60℃～65℃之间[2,3]。在气温较低时,六胺银溶液先用微波预预热,使六胺银溶液温度快速达到65℃,将切片放进溶液内开始染色,可以缩短在高温中的染色时间,减少黑色沉淀的形成。随时查看染色进度,每隔 10 m i n取出切片在显微镜下观察,不足继续浸染,直至肾小球基底膜呈黑色,清晰显示出基底膜时,即可终止染色。

做好每一张六胺银染色是很不容易的,相信每一个操作人员,经过反复多次的染色,对成功与失败的经验进行彻底地分析和总结,不断积累丰富的经验,熟练生巧,充分掌握六胺银染色的关键步骤,会染出非常满意的切片的。

要做好六胺银染色,应该注意以下几点:

(1)组织取材后,要及时、充分的固定。

(2)载玻片应进行放脱片处理,摊片要平整,不能有皱褶。

(3)染色所用玻璃器皿要严格清洗,经酸浸泡,再用蒸馏水冲洗干净,保证所用器皿的洁净度,不留任何杂质,否则染液会出现混浊现象。

(4)配制的染液要即时使用,保存于冰箱,保证染液的新鲜度,氧化要充分。

(5)要随时观察染色进度,严格控制染色时间,不能过染。

(6)染色过程中使用塑料镊子,以防金属镊子与银染液发生反应,造成银污染切片。

[1] 张健,刘涛,朱礼国,等.肾穿刺组织六胺银染色的改进[J].郧阳医学院学报,2005,24(1):49.

[2] 张威,梁英杰,赖英英.自控微波技术在肾穿刺活检六胺银染色中的应用[J].中山医科大学学报,2002,23(9):143-144.

[3] 周颖川.肾穿刺标本制片的质量控制[J].现代医药卫生,2007,23(9):1355-1356.

[4] 骆新兰,蔡秀,王朝杰,等.肾小球基膜六胺银染色的比较[J].临床与实验病理学杂志,2005,20(4):493-494.

[5] 朱国良,张晓岚,石麒麟.微波改良肾穿刺活检六胺银染色[J].中国中西医结合肾病杂志,2010,11(1):66-67.