不同方法制备壳聚糖微囊形成机理初探

王 玮,金邻豫,白 颖,张海峰,许秋菊

(1.河南大学药学院药剂学教研室,河南 开封 475004;2.河南大学化学化工学院仿真实验室,河南 开封 475004)

不同方法制备壳聚糖微囊形成机理初探

王 玮1,金邻豫2,白 颖1,张海峰1,许秋菊1

(1.河南大学药学院药剂学教研室,河南 开封 475004;2.河南大学化学化工学院仿真实验室,河南 开封 475004)

目的:对不同方法制备壳聚糖微囊的成囊机理进行初步探讨。方法:采用单凝聚法、复凝聚法和乳化固化法分别制备壳聚糖微囊,结合传统理论解释,对相关影响因素进行评价。结果:各种方法成囊机理不同,影响较大的因素也互不相同。结论:通过对这些方法制备壳聚糖微囊成囊机理的研究,可以为优化壳聚糖微囊制备工艺提供理论依据和参考。

壳聚糖;微囊;形成;机理

壳聚糖(Chitosan,CS)是一种天然的阳离子聚合物,生物相容性好,具有生物黏附性;在体内可被溶菌酶、胃蛋白酶等多种酶酶解,具有优良的生物降解性和成膜性;有促进伤口愈合、降血脂、降胆固醇等生物活性;对肿瘤细胞有选择性吸附作用,可直接抑制肿瘤细胞,与抗癌药物合用可增强抗癌作用等,因此它是一种优良的微囊载体材料。近年来关于壳聚糖微囊制备的报道很多[1-2],但多侧重于其具体的制备工艺,而对于其机理则较少报道。为此,本文以5-氟尿嘧啶为模型药物和壳聚糖为囊材,分别采用了单凝聚法、复凝聚法和乳化固化法制备壳聚糖微囊,在此基础上对其成囊机理进行初步研究。

1 材料与仪器

1.1 材料

壳聚糖(济南海得贝海洋生物工程有限公司,20061107);5-氟尿嘧啶原料药(武汉合中生化制造有限公司,20080506);海藻酸钠(天津信达化学试剂有限公司,20080311);无水CaCl2(上海晨光化学试剂有限公司,20071018);其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

CL-3型恒温加热磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司);YP-600型电子天平(上海第二天平仪器厂);SZ-93型自动双重纯化水蒸馏器(巩义市英峪予华仪器厂);101型电热鼓风干燥箱(北京中兴伟业仪器有限公司);EXSTAR-6000型热分析系统(Seiko Instruments Inc.)等。

2 壳聚糖微囊形成机理传统理论

2.1 降低壳聚糖溶解度

单凝聚法也叫沉淀法,属于物理方法。壳聚糖只溶于稀酸溶液中,形成带正电荷的聚电解质,其溶解性与溶液中存在的其他阴离子性质密切相关,当溶液中存在醋酸盐、乳酸盐或谷氨酸盐时壳聚糖的溶解度会提高[3],这种现象称为盐溶;当存在磷酸盐、聚磷酸盐或硫酸盐时,它们与水分子的亲合力大于壳聚糖,溶液的离子强度发生改变,壳聚糖所带正电荷被大量中和,从而降低了壳聚糖的溶解度使其沉淀析出,这种现象称为盐析。单凝聚法利用这个原理,向壳聚糖稀酸溶液中滴加沉淀剂(也称凝聚剂)来制备。

2.2 相反电荷离子间相互作用

复凝聚法是利用2种相反电荷的高分子材料以离子间相互作用而交联形成复合微球或微囊,也属于一种物理方法。由于壳聚糖的酸性水溶液带正电荷,因此可以选用任何阴离子聚合物来与其复合。目前常用的与壳聚糖复凝聚的材料是海洋多糖海藻酸钠[4],其次是酪蛋白和明胶。海藻酸钠的固化主要是靠Ca2+,与壳聚糖之间的离子作用是辅助性的。

2.3 形成乳液后交联固化

乳化-固化法是制备生物降解性高分子、天然高分子微球或微囊最常用的方法。其机理是首先用各种乳化方法制备乳液,然后用除去溶剂的方法使分散相固化。针对不同的包封物和聚合物材料,所采用的具体方法也不同。本课题研究的内包物和囊材均为水溶性物质,此时一般采用 W/O型乳液,将聚合物和内包物溶解于水,使其分散于油相制成W/O型乳液,然后通过对聚合物交联得到微囊。

3 不同方法制备CS微囊机理的探讨

3.1 单凝聚法

3.1.1 制备方法 称取一定量的壳聚糖,充分溶解于体积分数为2%稀醋酸中,配成壳聚糖醋酸溶液。量取20mL该液于烧杯中,加入100mg的5-氟尿嘧啶,使溶解完全,加入表面活性剂1mL于恒温磁力搅拌器中,保持温度为50℃,开始搅拌30min,加入NaOH溶液调p H值为5.5,加入凝聚剂,搅拌中再加入稀释剂,20min后加入戊二醛溶液(体积分数为5%)0.5mL,开始固化 2 h后 ,洗涤,抽滤,干燥 ,即得。

3.1.2 机理探讨 由单凝聚法的原理可知,该法主要是通过降低CS的溶解度而凝聚成囊。影响CS胶凝的主要因素有浓度、温度、电解质和交联剂等。

3.1.2.1 壳聚糖浓度和黏度对成囊的影响 按照

3.1.1项下实验方法的设定,其他条件相同的情况下改变壳聚糖浓度,考察该因素对成囊的影响(表1)。由表1所示,当壳聚糖浓度在0.1%～0.5%左右时候,能形成均匀的圆形微囊,且粒径随着浓度的升高而增大。随着壳聚糖浓度升的更高时,壳聚糖醋酸溶液的黏度将会增加,不易成囊。

表1 壳聚糖浓度对成囊情况的影响

3.1.2.2 温度对成囊的影响 按照3.1.1项下实验方法的设定,其他条件相同的情况下改变反应体系温度,考察该因素对成囊的影响(表2)。由表2所示,当反应温度为50℃时该反应体系所成的微囊包封率理想,微囊粒径均一度高。当温度太高时,由于溶剂蒸发,形成局部浓度过浓,囊材相互凝聚而不能成囊。在显微镜下可见壳聚糖成絮状凝出。如温度太低,由于囊材相互之间不能很好融熔,因此成囊也不理想。当凝聚成囊后,必须使其在较低的温度下胶凝。

表2 温度对成囊情况的影响

3.1.2.3 凝聚剂对成囊的影响 电解质对胶凝的影响,阴离子起主要作用,其电荷数愈高胶凝作用愈强。常见的阴离子中,促进胶凝的作用最强,Cl-次之,而SCN-则可阻止胶凝。据此,本文所选用的凝聚剂是Na2SO4,所需加入的量与所使用的壳聚糖的分子量有关,随着分子量的增加而增加。

3.1.2.4 交联剂对成囊的影响 如不加入交联剂固化,在沉淀微囊时,药物易扩散到微囊外的水相,导致微囊对药物的包封率不很高。凝聚囊的固化可用囊材的理化性质不同而选择不同的交联剂,采用壳聚糖为囊材时,一般采取醛类,如甲醛、戊二醛等,温度一般控制在0～5℃。甲醛导致交联的程度与许多因素有关,一般在浓度大、时间长、介质p H8～9时交联才能完全。若囊心物在碱性介质不稳定时,可用体积分数为5%戊二醛,后者在中性介质中也能完成交联,其交联作用可采用席夫反应(Schiff’s reaction)表示,线性高分子囊材通过化学反应联接成网状或体型高聚物,形成一层致密的保护膜而包封芯材形成微囊,使其具有一定强度。按照3.1.1项下实验方法的设定,其他条件相同的情况下改变反应中戊二醛的量,考察该因素对成囊的影响(表3)。由表3所示,若交联不足则微囊易粘连,若交联过度,所得微囊脆性太大。

表3 戊二醛用量对成囊情况的影响

3.2 复凝聚法

3.2.1 制备方法 首先用体积分数为2%的醋酸溶液配制0.6mol/L CaCl2的醋酸溶液200mL,然后加入一定量、一定规格的壳聚糖,搅拌溶解,过滤,室温静置过夜。称取一定量海藻酸钠溶解于200mL蒸馏水中,再加入称好的一定量的5-氟尿嘧啶。以此溶液作为水相,滴入 50mL植物油(含2.5mL/Span-80)乳化10min,得W/O型乳液。然后将以上制得的壳聚糖溶液用连接8号针头的注射器缓慢滴加到乳液中,以500 r/min的速度搅拌30min,室温静置12 h。用石油醚除去油相,微囊用石油醚、异丙醇分别洗涤3次,抽滤,真空干燥即得5-fu-海藻酸钠-壳聚糖微囊。

3.2.2 机理探讨 将被包埋药物溶于海藻酸钠溶液中,然后将该溶液滴加进含离子交联剂CaCl2的壳聚糖溶液中[5],海藻酸盐将变成不溶的海藻酸钙而固化成微囊,同时与壳聚糖形成离子聚合体,使壳聚糖吸附在海藻酸钙微囊的表面或进入内部。为探讨5-氟尿嘧啶-壳聚糖复合微囊形成机理,对5-氟尿嘧啶、海藻酸钠、壳聚糖和复合微囊进行DSC分析,所得的谱图见图1和图2。

图1 壳聚糖与复合微囊的DSC图

图2 海藻酸钠和5-氟尿嘧啶的DSC谱图

由图1、图2可以看出,荷负电的海藻酸钠、荷正电的壳聚糖在其最终的反应产物的DSC谱中自身的特征峰均消失,最终产物出现了新特征峰,说明各组分不是以各自独立的形式存在于产物中,它们之间发生了静电作用,以新的相互结合状态存在。经考察,各种影响壳聚糖-海藻酸钠复合微囊成囊的因素如下:①壳聚糖的脱乙酰度对成囊的影响:按照3.2.1实验方法的设定,在其他条件相同的情况下使用不同脱乙酰度[5]的壳聚糖,考察该因素对成囊的影响(表4)。由表4可以看出,脱乙酰度越大越不利于微囊的形成,因为脱乙酰度越大,壳聚糖的黏度越小,壳聚糖的阳离子电荷密度也就越大,不利于与荷负电的海藻酸钠发生静电交联反应。②壳聚糖和海藻酸钠的浓度对成囊的影响:实验的结果表明,在进行最佳制备条件优化时,只有当复凝聚的两种物质电荷相等时,才能获得最大收率,其中当壳聚糖的浓度小于质量分数为1%时不能成囊,而且壳聚糖和海藻酸钠的浓度也不能过高,粒径会随浓度的提高而增加,微囊不能分散开,且有较大面积的粘连;③p H对成囊的影响:海藻酸钠易溶于水,是一种电荷密度很高的聚电解质。由实验可以看出,p H值是影响成囊的一个重要条件,主要是因为随着反应体系的p H值的变化,体系中的-和-COO-基团的数目会相应发生变化。当 p H接近海藻酸钠的 p Ka时,其界面上-COO-基团的浓度很高,暴露的-COO-基团很少,而微囊囊膜的形成主要发生在海藻酸钠的-COO-和壳聚糖的-之间,壳聚糖与海藻酸钠的络合程度因此而增强或减弱。当壳聚糖溶液的p H<5.50时,影响壳聚糖键合程度的主要因素是壳聚糖分子的电荷数量;当p H>5.50时,尤其是当接近其等电点时,影响壳聚糖键合程度的主要因素是壳聚糖分子的空间结构。

表4 脱乙酰度对成囊情况的影响

3.3 乳化固化法

由于壳聚糖溶于稀酸溶液,因此采用W/O型和O/W/O型乳液固化法分别包埋水溶性和脂溶性药物。乳液的固化方法是蒸去壳聚糖溶液中的水分使微球或微囊固化,也可使用化学交联或物理交联的方法来固化。由于壳聚糖带有氨基,因此采用化学交联法进行固化是经典且常用的制备方法。本文使用的模型药物是5-氟尿嘧啶,属于水溶性药物,因此要首先制备W/O型乳液,制成乳液后加入戊二醛使其扩散进入壳聚糖水相,使壳聚糖交联成微囊或微球。亲水性药物则均匀地分散在微囊或微球中,如果是脂溶性药物则被包埋在壳聚糖微囊内的各个小空腔内,释药时必须先扩散进入壳聚糖内,再扩散至微囊外,因此两者将显示不同的药物释放行为和释放速度。由两种药物的油水分配系数可知,水溶性药物的释放速度将远远大于脂溶性药物。以下为探讨各种影响乳化固化法制备微囊的因素。

3.3.1 制备方法 取15mL一定浓度的壳聚糖醋酸(体积分数为2%)溶液,置于250mL烧杯中,一次加入一定量的5-氟尿嘧啶,2 g的span80,60mL的液体石蜡,以1000 r/min的转速开始搅拌,20min后进行超声处理,10min后倾入60mL乙醚液(含有一定量戊二醛)中,以800 r/min继续搅拌2 h,经石油醚、正丁醇洗涤后,干燥,即得。

3.3.2 机理探讨

3.3.2.1 壳聚糖浓度对成囊的影响 按照3.3.1实验方法设定,其他条件相同的情况下改变壳聚糖浓度,考察该因素对成囊的影响(表5)。由表5可以看出,壳聚糖浓度过小时,制得的微囊形状不好,强度较差,容易粘连;壳聚糖浓度过大时,壳聚糖溶液黏度大,不易分散,且生成的粒径较大,包封率也有提高。

表5 壳聚糖浓度对成囊情况的影响

3.3.2.2 戊二醛用量对成囊的影响 按照3.3.1实验方法的设定,其他条件相同的情况下改变反应中戊二醛的量,考察该因素对成囊的影响,结果如表6所示,其中交联度为戊二醛的醛基与壳聚糖的氨基之比。由表6可知,戊二醛在进行交联固化的时候,交联度越大,交联网络的孔径越小,对药物小分子的包裹越紧密,表现为包封率越大。

表6 戊二醛用量对成囊情况的影响

3.3.2.3 芯壁比对成囊的影响 按照3.3.1实验方法的设定,其他条件相同的情况下改变反应中的芯壁比,考察该因素对成囊的影响(表7)。由表7可知,随着芯壁比的增加,包封率降低,载药量升高。

表7 戊二醛用量对成囊情况的影响

4 讨论

4.1 单凝聚法制备壳聚糖微囊的形成机理及对其影响因素的评价

影响高分子囊材胶凝的主要因素有浓度、温度、电解质和交联剂等。采用单凝聚法制备壳聚糖微囊时,浓度不能过高,一般控制在0.1%～0.5%之间;反应温度一般控制在50℃左右,交联固化温度一般控制在0～5℃;凝聚剂加入的量与壳聚糖的分子量成正比的关系;若交联不足则微囊易粘连,若交联过度,所得微囊脆性太大。

4.2 复凝聚法制备壳聚糖微囊的形成机理及对其影响因素的评价

脱乙酰度越大越不利于微囊的形成;当复凝聚的两物质的电荷相等时,才能获得最大的收率;p H值是影响成囊的一个重要条件,一般应控制在3～6之间。

4.3 乳化固化法制备壳聚糖微囊的形成机理及对其影响因素的评价

壳聚糖浓度在过小或过大时均不能得到分散均匀、外观好的微囊,实验的结果表明其在质量分数为2.5%～3.5%之间时比较理想;交联度越大,包封率越大;随着芯壁比的增加,包封率降低,载药量升高。

通过对壳聚糖微囊形成机理的研究,将为优化壳聚糖微囊的制备工艺提供理论依据和参考,并为工厂大量生产带来实际价值。

[1]莫名月,李国明,方雷.壳聚糖载药微囊的制备及应用研究进展[J].天津化工,2005,19(6):1-3.

[2]刑福保,成国祥,杨炳兴,等.微囊微球的物理化学制备技术及其应用研究进展[J].胶体与聚合物,2003,21(2):39-42.

[3]崔福德.药剂学[M].5版.北京:人民卫生出版社,2004:367-369.

[4]魏靖明,张志斌,冯华,等.海藻酸钠作为药物载体材料的研究进展[J].化工新型材料,2007,35(8):20-22.

[5]Gombotz W R,Wee S F.Protein release from alginate matrices[J].Advanced Drug Deliver Reviews,1998,31(3):267-285.

[责任编辑 姬 荷]

Preliminary study on the possible mechanisms of chitosan microcapsules prepared by various methods

WANG Wei1,JIN Lin-yu2,BAI Ying1,ZHANG Hai-feng1,XU Qiu-ju1(1.Pharmaceutical College of Henan University,Kaifeng,Henan475004,China;2.Chemistry&Chemical Engineering College of Henan University,Kaifeng,Henan475004,China)

Objective:To study the possible mechanisms of chitosan microcapsules prepared by variousMethodspreliminarily.Methods:Some chitosan microcapsules were prepared by monophasic coagulation method,complex coacervation method and emulsion crosslinking method,then the evaluation of related factors were conducted through the traditional theory.Results:The sacculation mechanism model and factors varies with different preparation methods.Conclusion:The research on the possible mechanisms will provide a theoretical basis and reference for optimizing technique to prepare chitosan microcapsules.

chitosan;microcap sules;form;mechanism

O636

A

1672-7606(2010)04-0253-05

2010-09-12

河南大学校内基金项目(04YBRW060)

王玮(1964-),男,河南 开封 人,博士,硕士生导师,教授,从事药物缓控释与微粒靶向制剂的研究工作。