白藜芦醇乳脂体的制备和工艺考察

陈洪轩,陈倩倩,刘万路,史 荣,徐志杰

(1.河南大学药物研究所,河南 开封 475004;2.河南大学药学院药剂学教研室;河南 开封 475004)

白藜芦醇乳脂体的制备和工艺考察

陈洪轩1,2,陈倩倩2,刘万路2,史 荣2,徐志杰2

(1.河南大学药物研究所,河南 开封 475004;2.河南大学药学院药剂学教研室;河南 开封 475004)

目的:采用薄膜分散法制备白藜芦醇乳脂体,并对其进行处方及工艺优化。方法:以包封率为指标进行正交设计优化处方工艺。结果:制备白黎芦醇乳脂体最佳处方为:磷脂与三硬脂酸甘油酯比例30∶1,磷脂与胆固醇比例10∶1,药物与磷脂比例1∶25,磷脂与吐温-80比例5∶1。最佳工艺为:水合时间90min,水合温度35℃,水浴温度45℃,超声时间12min。结论:该处方工艺可行,所制备的白藜芦醇乳脂体具有较高包封率。

白黎芦醇;乳脂体;薄膜超声分散法

乳脂体(Emulsome)[1]是近年来研究较多的一种新型药物载体,由甘油三酯组成固体脂肪核,外周被一个或多个磷脂双层包围,因中心具有疏水核,类似普通的O/W乳剂,外周又被至少一层的磷脂层稳定,类似脂质体。它具有乳剂和脂质体的特点,能高浓度地将亲脂性药物包于中心疏水核中,还能将水溶性药物包于磷脂层环绕的水性隔室中。乳脂体静脉注射后主要在肝、脾、肺等组织器官中蓄积,从而提高药物的治疗指数,减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。

白藜芦醇[2](Resveratrol,RES)又称芪三酚,是含芪类结构的二苯乙烯芪类、非黄酮类多酚物质,易溶于乙醚、氯仿等中,对光不稳定。RES对心血管疾病有明显的治疗和预防作用,体内、外实验表明它还能够诱导大部分肿瘤细胞凋亡,具有抗肿瘤活性[3]。由于RES难溶于水,不易被吸收,给药后体内消除半衰期短,在血液中可较快地清除,而乳脂体可包封脂溶性药物,所以本文将白藜芦醇制成乳脂体,延长其体内作用时间,提高其生物利用度。

1 实验仪器与材料

高效液相色谱仪(SPD-6A紫外检测器、LC-5A型高压泵、7125进样阀20μL样品管,Shimadzu LC-5A,Japan);J Y92-llN型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有效公司);RE-52AA型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);SHB-III型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);白藜芦醇(郑州荔诺生物科技有限公司,含量98%);注射用大豆磷脂(上海太伟药业有限公司,注射级,批号030321);三硬脂酸甘油酯(上海汶水化工有限公司,化学纯);其他均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 白藜芦醇乳质体含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相为甲醇∶水(80∶20);流速0.8mL/min;检测波长306nm。

2.1.2 标准曲线的绘制 精密秤取白藜芦醇乳质体标准品2.5mg置于25mL容量瓶中,加甲醇适量超声使标准品溶解,用甲醇定容至刻度,混匀,得0.1 g/L的白藜芦醇标准品储备液。精密取10mL储备液,置于100mL容量瓶中,以甲醇定容至刻度,摇匀,得浓度为10mg/L的RES标准溶液。精密吸取RES标准品储备液 0.05、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0mL分别置于10mL容量瓶中,以甲醇定容至刻度,摇匀 ,得浓度分别为 0.05、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0mg/L的系列溶液,分别进样20μL,以峰面积(A)为纵坐标。以浓度(C)为横坐标进行线性回归,标准曲线方程:

即RES在浓度0.05～25mg/L范围内,峰面积与测定浓度曲线呈良好的线性关系,回收率高,重现性好,能准确快速的进行含量测定。

2.2 包封率测定方法的建立

取已混匀RES乳脂体混悬液,0.45μm微孔滤膜过滤除去未包封的药物,精密吸取续滤液0.2mL,于2mL量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,HPLC法测定浓度 (Ct)。另精密吸取已混匀的RES乳脂体混悬液0.2mL,与2mL量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,HPLC法测定浓度 (Ce),按如下公式计算包封率:

式中:Ce为乳脂体混悬液中总药物浓度;Cf为游离药物浓度;Ct为乳脂体中包裹的药物浓度。

2.3 白藜芦醇乳脂体制备方法的筛选

拟定初步处方,分别采用薄膜超声分散法、逆相蒸发法和冻融法3种方法制备白藜芦醇乳脂体,得到1～3号样品溶液,分别用微孔滤膜过滤,参照2005年《中国药典》中脂质体包封率的测定方法,测定包封率,结果见表1。由上表可看出,薄膜超声分散法的包封率较高。本实验采用薄膜超声分散法制备乳脂体。

表1 3种方法制得的RES乳脂体的包封率

2.4 处方工艺单因素考察

2.4.1 处方单因素考察

2.4.1.1 药物与磷脂的比例对包封率的影响 考察了药物与磷脂比例为 1∶05、1∶10、1∶15、1∶25、1∶50对包封率的影响,结果见图1。药物与磷脂比例为1∶25时,乳脂体的包封率较高。

图1 药物与磷脂的比例对包封率的影响

2.4.1.2 胆固醇与磷脂的比例对包封率的影响 考察了胆固醇与磷脂比例为 1∶02、1∶10、1∶15、1∶25、1∶30时的包封率,结果见图2。胆固醇与磷脂比例为1∶10时,乳脂体包封率较高。

图2 胆固醇与磷脂的比例对包封率的影响

2.4.1.3 磷脂与三硬脂酸甘油酯的比例对包封率的影响 考察了磷脂与三硬脂酸甘油酯的比例1∶01、5∶01、15∶01、30∶01、60∶01时的包封率,结果见图3。磷脂与三硬脂酸甘油酯比例为30∶01时,乳脂体的包封率较高。

图3 磷脂与三硬脂酸甘油酯的比例对包封率的影响

2.4.1.4 吐温-80与磷脂的比例对包封率的影响测定了吐温-80与磷脂比例分别为 0、1∶01、1∶05 、1∶10、1∶15时的包封率,结果见图 4。吐温-80与磷脂比例为1∶05时,乳脂体包封率较高。

图4 吐温-80与磷脂的比例对包封率的影响

2.4.2 工艺因素考察

2.4.2.1 水合时间的选择 分别测定了水合时间为0～200min时的包封率,结果见图5。当水合时间为90min时,包封率较高。

图5 水合时间对包封率的影响

2.4.2.2 水合温度的选择 测定了水合温度为0～50℃时的包封率,结果见图6。水合温度为35℃时,乳脂体包封率较高。

图6 水合温度对包封率的影响

2.4.2.3 水浴温度的选择 测定了0～70℃时的包封率,结果见图7。45℃时,脂质体初步稳定性较好,包封率高。

图7 水浴温度对包封率的影响

2.4.2.4 超声时间的选择 测定了超声时间为0～25min时对包封率的影响,结果见图8。超声时间延长,包封率增加,选择超声时间为12min。

图8 超声时间对包封率的影响

2.4.3 正交设计优化处方工艺 根据单因素考察,以RES与磷脂质量比(A)、胆固醇与磷脂质量比(B)、三硬脂酸甘油酯与磷脂质量比(C)、Tween-80与磷脂质量比(D)4个因素的不同水平考察对乳脂体包封率的影响(表2)。按L9(3＊4)安排试验,测定各处方RES乳脂体的包封率,结果见表3。各因素的影响程度为B>A>C>D。胆固醇与磷脂的质量比对RES乳脂体包封率的影响最大,吐温-80和磷脂的质量比影响最小。经筛选得优化组合为A1B3C1D2,即含药量0.5 g/L,药物与磷脂质量比为1∶25,胆固醇与磷脂质量比为1∶10,三硬脂酸甘油酯与磷脂质量比为1∶30,吐温-80与磷脂质量比为1∶5。

表2 因素水平表

表3 正交试验结果

2.4.4 制备 采用最佳处方和制备工艺,称取处方量的大豆卵磷脂、胆固醇、吐温-80和白藜芦醇溶于适量三氯甲烷,水浴超声2min溶解,得到乳脂溶液。将该溶液置于圆底烧瓶中,于45℃恒温水浴,减压旋转蒸发60min蒸去三氯甲烷,使磷脂等成膜材料在瓶底部形成一均匀类脂膜。向圆底烧瓶中加10mL水合介质,35℃水合90min,进行探头超声12min,得略透明乳脂体混悬液,即得。

3 讨论

乳脂体有多种制备方法: 薄膜分散法、冻融法、逆相蒸发法、乙醇注入法和乙醚注入法。由于三硬脂酸甘油酯不溶于乙醇和乙醚,后两种方法不适合制备。本文对比了薄膜分散法、冻融法和逆相蒸发法3种方法,确定采用薄膜分散法,此法操作简便、包封率高、重现性好。

筛选出薄膜超声分散法制备RES乳脂体,以包封率为考察指标,优化了处方及制备工艺。在该法中,乳脂体制备的关键是形成均一的类脂薄膜,使被包裹药物具有较高的包封率且不易从乳脂体中渗漏。

由于白藜芦醇对光不稳定,自然光照射条件下常温放置24 h,含量下降26%,室温棕色瓶放置24 h含量几乎无变化,所以在实验过程中应避光操作。

[1]Baur JA,Ainclair DA,Paul F.Therapeutic potential of resveratrol:the in vivo evidence[J].Nature Reviews Drug Discovery,2006,15(5):493-507.

[2]李延华,伟军.白藜芦醇的研究现状及应用前景[J].专论与综述,2008,3(7):46-50.

[3]向敏,匡小东.白黎芦醇及其药理保健功能的研究[J].中国食品添加剂,2004,28(5):16-20.

[责任编辑 姬 荷]

Preparation and process study of resveratrol emulsomes

CHEN Hong-xuan1,2,CHEN Qian-qian2,LIU Wan-lu2,SHI Rong2,XU Zhi-jie2(1.Institute of Chinese Meteria Medica of Henan University, Kaif eng, Henan 475004,China;2.Pharmaceutical College ofHenan University,Kaif eng,Henan475004,China)

Objective:To prepare resveratrol emulsome with thin film sonication method and to optimize its process.Methods:The entrapment efficiency of formulation and process factors were investigated,and the orthogonal optimization formulation was designed.Results:The better prescription for the preparation of resveratrol emulsome was the ratio of phospholipids and three stearic acid glyceride was 30∶1;the ratio of phospholipid and cholesterol was 10∶1;the ratio of phospholipids and drug was 25∶1;the ratio of phospholipids and the ratio of Tween-80 was 5∶1;the better process was as follows:the hydration time:90min;hydration temperature:35 ℃;water temperature:45 ℃;ultrasonic time:12min.Conclusion:The formulation technology is feasible,and the encapsulation efficiency of resveratrol emulsomes is high.

resveratrol;emulsome;thin film sonication

TQ460.6

A

1672-7606(2010)04-0266-04

2010-10-19

陈洪轩(1952-),男,河南杞县人,硕士生导师,副教授,从事现代给药系统和制剂新技术研究。