HEK293、COS7、7721、Hep G2和 PC12细胞内神经鞘磷脂合成酶活性比较

朱 珂,孙国涛,秦 睿,石渊渊

(河南大学医学院分子医学研究所,河南 开封 475004)

HEK293、COS7、7721、Hep G2和 PC12细胞内神经鞘磷脂合成酶活性比较

朱 珂,孙国涛,秦 睿,石渊渊＊

(河南大学医学院分子医学研究所,河南 开封 475004)

目的:分析比较 HEK293、COS7、7721、Hep G2和 PC12的细胞内神经鞘磷脂合成酶(SMS)的活性。方法:收集处于对数生长期的 HEK293、COS7、7721、Hep G2和PC12细胞,每种细胞的细胞浓度相同;5种细胞均建立2个酶促反应体系,反应时间分别是2 h和3.5 h;薄层层析和灰度扫描分析比较SMS活性强弱。结果:HEK293细胞内的SMS活性较强。结论:建立了有效检测不同来源细胞SMS活性比较的方法,发现 HEK293细胞具有较强的SMS活性,可以更好的用于神经鞘磷脂代谢的研究。

神经鞘磷脂;薄层层析;神经鞘磷脂合成酶;脂筏

神经鞘磷脂(sphingomyelin,SM)是人体内含量最多的鞘磷脂,是构成生物膜的重要组分。神经鞘磷脂合成酶(sphingomyelin synthase,SMS)是合成SM途径中的最后一个酶,它催化卵磷脂(Phosphatidylcholine,PC)和神经酰胺(ceramide,Cer)生成SM和甘油二脂(Diacylglycerol,DAG)。SMS的底物神经酰胺和产物甘油二酯是细胞内重要的信息物质,在炎症的发生、细胞增殖和凋亡的调节中起重要的生物学作用。细胞内的神经酰胺增加细胞膜的流动性,参与构成脂筏与细胞膜内陷,部分磷酸化后还可能参与了细胞的吞噬作用[1-2];DAG通过信号转导途径导致细胞增生或核型变化,引起细胞持续增生,诱导癌变。

有研究显示[3],SMS高表达对SM水平有调节作用;高表达SMS还有抗凋亡作用[4-5]。另有研究显示,采用RNAi技术抑制细胞内的SMS的表达后,细胞内的SM生成减少,神经酰胺堆积,TNF-α诱导的凋亡显著性升高[6]。此外,通过RNAi技术抑制细胞内SMS的表达后,细胞生长受抑制,然后再向此细胞内加入外源性的SM,细胞并不能恢复生长,说明SMS除了合成SM外,还参与调节细胞的生长和凋亡[7]。本文通过薄层层析法比较5种细胞内的SMS的活性,为以后深入研究SM奠定了基础。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

HEK293细胞由中国医学科学院基础医学细胞中心提供;COS7、7721、HepG2和PC12细胞购于上海细胞库;NBD-SM为Molecular probes公司产品;NBD-ceramide、Phosphatidylcholine为 Sigma公司产品;MEM和DMEM培养基为Invitrogen公司产品;薄层层析板为Whatman公司产品。

A/B3生物安全柜(Thermo Forma);TS100倒置显微镜(Nikon);HERA CELL二氧化碳培养箱(德国);IS-2200凝胶成像分析系统(Alpha)。

1.2 实验过程

1.2.1 细胞培养 HEK293、COS7、7721、HepG2 和PC12细胞生长于含体积分数为10%的胎牛血清和80 IU/mL硫酸庆大霉素的DMEM培养基中,在37℃、体积分数为5%的CO2、饱和湿度的条件下培养。

1.2.2 收集细胞 收集处于对数生长期的细胞,调细胞浓度,即每毫升细胞悬液90×104个,每种细胞约450×104个细胞。

1.2.3 提取细胞粗酶液 细胞悬液4000 rpm,10min离心,弃上清。每种细胞加入250μL匀浆液,重悬浮细胞。用玻璃匀浆器在冰上匀浆,收集匀浆液于离心管内离心4000 rpm,10min,收集上清于一新的离心管内,即是细胞粗酶液。

1.2.4 建立SMS反应体系 取粗酶液依次加入底物卵磷脂、NBD-神经酰胺和SMS反应缓冲液。每种细胞建立2组反应体系,置37℃恒温箱反应。一组反应2 h,另一组反应3.5 h。

1.2.5 层析 用氯仿/甲醇抽提有机相于一新的离心管内,自然挥干。再用氯仿溶解,点样于层析板,在氯仿-甲醇-氨水-水组成的展开体系里层析8min。

1.2.6 成像系统拍照 将层析板放入成相系统拍照。灰度扫描,分析。

2 结果

2.1 实验结果

酶反应体系中,在SMS的作用下,神经酰胺的C-1羟基上连接了磷酸胆碱生成SM,由于底物NBD-神经酰胺带有绿色荧光染料,生成的产物SM也带有绿色荧光染料,用带有绿色荧光染料的NBD-SM作标准,薄层层析法测SMS酶活性,经凝胶图像分析仪扫描,反应时间为2h和3.5 h的SMS活性强弱,结果如图1,图2所示。从左至右依次是 NBD-SM、HEK293、COS7、7721、HepG2和PC12细胞的SMS活性图谱。

图1 反应时间2 h神经鞘磷脂合成酶活性层析图谱

图2 反应时间3.5 h神经鞘磷脂合成酶活性层析图谱

图3 反应时间2 h凝胶图像灰度分析结果

图4 反应时间3.5 h凝胶图像灰度分析结果

2.2 结果分析

SMS酶活性凝胶图像经灰度分析,结果如图3、图4。反应时间2h时,HEK293的SMS活性是COS7的1.06倍、是7721的1.72倍、是 HepG2的1.92倍、是PC12的3.74倍。反应时间3.5 h时,HEK293的SMS活性是 COS7的1.51倍、是7721的1.72倍、是HepG2的1.76倍、是PC12的5.02倍。

3 讨论

HEK293是人胚肾细胞转化5型腺病毒DNA得到的细胞株。COS7是来源于非洲绿猴肾成纤维细胞并经SV40病毒基因转化的细胞株。7721与 HepG2是人肝肿瘤细胞株。PC12细胞株来源于鼠肾上腺嗜铬细胞瘤,是一个常用的神经细胞株。实验结果显示,HEK293、COS7、7721、HepG2 和 PC125 种细胞的SMS的活性依次减弱。SMS是SM合成的关键酶,SM、胆固醇和鞘磷脂等参与构成细胞膜脂筏。最近研究发现,细胞内大约65%的SM存在于脂筏内[8],脂筏微区将不同的信号分子积聚在同一区域,促进了它们之间的相互作用和信号转导通路的激活;SMS调节脂筏中的SM的水平和脂筏的功能,介导内吞、凋亡等[9-10],并影响DAG和神经酰胺的代谢[11]。无论上调或下调SMS活性都与有丝分裂和促凋亡信号介导有着直接的关联[12]。SMS以及SM对细胞生命活动有着重要的意义,在本实验中,采用薄层层析法,比较不同来源的细胞在2个时间点的SMS活性,发现SMS活性测定在2～3.5 h内稳定、可靠。籍此我们建立了有效的方法,鉴别不同来源的细胞系的SMS的活性。通过对不同细胞来源的细胞进行比较,我们发现HEK293细胞具有更高的SMS活性,可以更好地用于SM代谢的研究。

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[责任编辑 时 红]

Comparison of the sphingomyelin synthase activities in HEK293,COS7,7721,HepG2 and PC12 cells

ZHU Ke,SUN Guo-tao,QIN Rui,SHI Yua-yuan＊(Medical College ofHenan University,Institute ofmolecular Medicine,Kaif eng,Henan475004,China)

Objective:T o analyze and compare the activities in HEK293,COS7,7721,HepG2 and PC12 sphingomyelin synthase(SMS)which were commonly used in medical research.Methods:The HEK293、COS7、7721、HepG2 and PC12 cells was collected in each logarithmic phase,the concentration of which was the same.2 zymo-exciter systems was established by 5 kinds of cells.The activities of SMS were tested and compared at 2h and 3.5h.The SMS activities were analyzed and compared for their strength and weakness with thin layer chromatographic(TLC).Results:The SMS activity of HEK293 is the highest in HEK293 cells.Conclusion:In this study,an effective method was established to compare the activities of sphingomyelin synthase in different cell lines.The HEK293 cells has stronger SMS activity which means it can be better used in sphingomyelin research.

sphingomyelin synthase;thin layer chromatographic;sphingomyelin;lipid rafts

Q545.3

A

1672-7606(2010)04-0275-03

2010-08-30

国家自然科学基金项目(30800175);河南省教育厅自然科学基金项目(2006180004)

朱珂(1984-),男,河南周口人,硕士研究生,从事脂代谢与糖尿病的研究工作。

＊通讯作者:石渊渊(1951-),女,河南济源人,教授,从事脂代谢与动脉粥样硬化的研究工作。