犬附红细胞体病需要研究的问题*

孔庆波

(公安部警犬技术学校,辽宁沈阳 110034)

犬附红细胞体病(Canine eperythrozoonosis)是由犬附红细胞体(Canine Epery throzoon)寄生于红细胞表面、血浆、组织液及脑脊髓液所引起的一种人畜共患传染病。犬的附红细胞体病临床上以发热、贫血、黄疸、腹泻、渐进性消瘦为主要特征,感染率较高,但多呈隐性经过,当机体免疫功能下降或处在应激状态时出现急性临床症状。1928年Schilling和Dinger分别在啮齿类动物中查到球状附红细胞体(E.coccooides)[1],以后相继在其他动物和家畜中也发现有附红细胞体。在我国,晋希民于1981年首先报道兔附红细胞体病,随后相继在牛、山羊、猪等家畜体内发现附红细胞体;而犬附红细胞体病是1991年7月～10月首次发现于上海地区[2]。临床研究发现,隐性感染的犬不仅在应激反应时会暴发而且会与其他疾病并发,给诊疗带来困难,甚至造成大量死亡。一般认为,附红细胞体病的发病率高,死亡率低,但也有发病率高,死亡率也高,即犬感染该病死亡率可高达80%的报道[2]。

20世纪80年代以来,国内外学者对附红细胞体病进行了深入的研究,使这种人畜共患病越来越引起兽医工作者的重视,但研究主要集中在猪等一些主要的经济动物上,而对犬附红细胞体病的研究还相对较少或不够深入,有些资料和数据还主要来源于其他动物。由于近几年我国养犬业的巨大发展,全国各地对犬附红细胞体病出现大量的报道,并随着临床病例增多而呈暴发流行趋势,严重危及犬的生命健康,该病的流行和危害已引起犬病研究及临床工作者的广泛关注。本文主要就近几年国内外对犬附红细胞体病研究中存在的一些问题,在病原学、流行病学、发病机理、临床症状及诊断和预防等几个方面进行一些探讨,以期为更加深入研究和控制犬附红细胞体病提供参考。

1 病原学研究存在的问题

1.1 病原的分类不明确

关于本病病原体的分类,国内外尚有争议,因为附红细胞体既有原虫特点,又有立克次体的特征,其分类地位尚未完全确定。多数学者根据1984年第八版《伯杰氏细菌鉴定手册》的分类将其列为立克次体目(Rickettsiares),无形体科(Anap lasmataceae),附红细胞体属。近年来,随着对附红细胞体的深入研究,1997年 Neimark H等[3]采用DNA测序、PCR扩增和16 S rRNA序列分析,发现其生物进化树的基因序列与柔膜体科的支原体属较为接近,其同源性可达到80%～90%,这种广泛寄生于脊椎动物的无细胞壁生物在支原体属的肺炎型组内形成一个新的分支,因此又被命名为球形支原体(Mycop lasma coccoides comb.Nov.,MCCN)。与此类似,Messick JB等[4]和Euzby J[5]用同样的方法,在犬血液中发现的附红细胞体样寄生物被命名为犬嗜血支原体(Mycop lasma haemocanis comb.Nov.,MHCN)。但 Uilenberg G G等[6]通过研究发现附红细胞体与支原体属的16 S rRNA基因序列的同源性并不是很高,因此认为,列入同一种属的依据不充分。由于附红细胞体属类的病原微生物主要寄生在红细胞表面并很可能是借助吸血昆虫传播,而支原体属的绝大多数病原体以非红细胞为主要寄生对象,且不需要特殊的媒介就可以在哺乳动物及人之间传播。因此,很多学者建议应测定整个附红细胞体基因组序列,结合其他生物学特性确定其种属分类地位。病原的分类不明确和标准不统一,势必影响对犬附红细胞体病的深入研究,这一问题也是目前研究的热点问题之一。

1.2 病原体外分离培养较为困难

附红细胞体以红细胞作为生长载体,属于细胞依赖性体外培养,因此,真正纯化的非细胞依赖性的附红细胞体培养以及体外分离较为困难。Nonaka N等[7]通过试验观察发现感染附红细胞体的红细胞对葡萄糖的消耗量增加,观察到附红细胞体在生长过程中要消耗葡萄糖,并指出附红细胞体可能是通过糖酵解的方式代谢葡萄糖,最终生成乳酸。华修国等用血液普通肉汤、营养琼脂、沙堡弱琼脂培养基分离培养犬附红细胞体,结果均为阴性。目前,国内外关于附红细胞体在体外培养的报道不断出现,打破了附红细胞体只能在活细胞内生长繁殖的说法。张守法等用 BPM I-1640、M-199、D-MEM 3种培养液作为基础培养基,再分别按体积分数加入400 mL/L的犊牛血清,采用普通恒温培养箱(37℃)进行牛附红细胞体的体外培养获得成功,其中在BPM I-1640培养基中,每12 h更换一次培养液,并补充适量正常红细胞,获得了99%的感染率,连续传代可达44代以上,这对附红细胞体的进一步深入研究奠定了基础,但这种方法对犬附红细胞体的分离培养重复性并不好,原因如何有待进一步探讨。

1.3 其他方面

犬附红细胞体病的病原学研究在国内还比较少,而且不系统也不深入,某些问题还似是而非(如形态学特点、生物学特性等),或一些所谓的研究结果大量参考了其他动物的类似研究资料,结论不能使人信服或有很大出入。事实上,对犬附红细胞体的研究在许多方面至今还是空白,如其微细结构和化学组成、不同动物感染的附红细胞体有何本质区别等,这都需要我们进一步进行深入和系统的研究。

2 流行病学研究存在的问题

2.1 生活史不清楚

犬附红细胞体的生活史至今尚不清楚,甚至其体内分布部位都存在争议。动物感染附红细胞体后,可在动物血液、组织液和脊髓液中游离[8],其中在绵羊和人等骨髓中浓度最高,其次是全身末梢血液,而动、静脉血中的附红细胞体含量相对少,这说明动物感染附红细胞体后,骨髓是最好的增殖场所[9-10],而后释放到血液中。末梢血液中含量多于循环血液,可能是末梢血液流动缓慢而循环血液流动相对快,与机械性的作用有关[11]。犬附红细胞体主要寄生在犬的红细胞表面、血浆及骨髓中[12],而对于猪球形附红细胞体来说,只存在于血浆中[13],但也有人报道指出,在眼球及脑组织[14]、肝、脾、肾中也有附红细胞存在[15-16]。

至于附红细胞体在宿主体内如何发育,如何移行,研究认为附红细胞体在宿主红细胞上以出芽方式增殖[2];而许耀成等在显微镜下看到的单核个体是裂殖子,多核个体是裂殖体,从裂殖子到裂殖体,再到裂殖子的反复过程,即是裂殖生殖,也就是无性繁殖过程。由于这个过程是在猪体内进行的,故认为猪是中间宿主,而终末宿主可能是节肢动物。至于犬附红体的生活史,目前国内外相关报道较少。

2.2 传播途径不明确

由于犬附红细胞体的生活史至今尚不清楚,故其自然传播途径也不十分明确。研究发现该病多发于夏秋时高热、多雨且蚊虫繁殖孳生季节,南方发病率高于北方。目前国内外学者普遍认同的犬附红细胞体传播途径有接触、昆虫媒介、血源传播等3种方式[2]:①接触传播是指患犬与健康犬之间、患有附红细胞体感染的人群与健康犬之间通过直接接触而发生的传播;②昆虫媒介传播是指经吸血昆虫如虱子、蚊子、蛰蝇、牛虻和疥螨等的携带与叮咬而发生的传播,这种传播方式是该病的重要途径[17];③血源传播是指用了被附红体污染的注射器、针头等医疗器械,以及去势、打耳号等,或通过互相舔咬破损的伤口传播。其他传播途径,如垂直传播,现已在猪、奶牛发现可垂直传播,鸡的附红细胞体感染不能经卵垂直传播已得到证实,犬附红细胞体是否可经过垂直传播目前还存在争议。笔者对两窝感染有附红细胞体的母犬所产的仔犬在产后马上检测并未发现感染有附红细胞体,但周向阳通过对母犬及新生仔犬的监测,从临床上证实了在犬中存在着母体与胎儿间的垂直传播关系,这是否与检测方法和检测时间有关,或其他原因还需进一步证实。有文献报道,人也可垂直传播[18]。另外,对于接触感染也有不同的观点。据周向阳报道,接触附红细胞体病犬的2名畜牧兽医人员和1名训导员被感染了犬附红体病。但日本的其田三夫报道[19],与患羊同群的四只绵羊并没有感染附红体病。所以接触感染是否成立也有待研究,而犬附红细胞体是否可经过交配传播目前尚无报道。张伟清等报道可经消化道传播。贾杏林研究认为空气也可以传播该病。

总之,以上传播途径对于犬附红细胞体来说,还没有资料显示在国内针对这一问题进行过具体和系统的研究工作,大多数资料是来自于对其他动物的研究。但附红细胞体病的传播有多种途径已是不争的事实,这对制定行之有效的防治措施极为重要。

2.3 宿主特异性的问题有待考证

已经证明附红细胞体是人畜共患的疾病,而且研究证明附红细胞体能感染多种动物,但对于不同动物感染的附红细胞体是否具有特异性,报道不尽一致。有资料证实,猪的附红细胞体只感染猪而不感染野猪[20]。虽然猪、牛、羊、犬、兔、鸡和人等都是附红细胞体的易感动物,其中却以猪感染附红细胞体后发病最为严重,而且有的资料指出猪的附红细胞体宿主特异性强。但张伟清等试验结果证明,猪的附红细胞体可以通过荐臀部皮下注射感染小鼠,被感染的小白鼠全血也可以再感染同宿主,表明猪的附红细胞体可以在小鼠体内繁殖,并证明犬、人附红细胞体也具有同样的特性。犬附红细胞体不但能感染小鼠,而且周向阳报道,接触附红细胞体病犬的2名畜牧兽医人员(只有2名畜牧兽医人员)和1名训导员(共有10名训导员)被感染了犬附红细胞体病,即犬附红细胞体还能感染人。至于接触附红体病犬的2名畜牧兽医人员和1名训导员是否被感染的就是犬附红细胞体,笔者认为还需进一步证明,因为与附红细胞体病犬接触的6名饲养人员和6名其他相关人员却无一人被感染了犬附红细胞体,而且周向阳并没有试验分离鉴定2名畜牧兽医人员和1名训导员被感染的附红细胞体就是犬附红细胞体。

3 致病机理尚未完全揭示

犬附红细胞体的致病机理尚未完全揭示,目前主要有以下两种说法。

其一,犬感染附红细胞体后多呈潜伏状态,不一定表现出临床症状。附红细胞体与红细胞有一定亲和性,主要由于红细胞本身的静电引力或受体-配体的黏附性使附红细胞体能吸附于红细胞上,并从中吸取养分,使红细胞膜出现损伤,甚至出现空洞[21]。魏梅雄等在试验中发现,红细胞呈空斑样、空泡样或齿轮样病变。由于红细胞被附红细胞体寄生后,其细胞膜通透性增加和膜脆性增高,还有的出现膜凹陷和空洞,使血浆进入红细胞内引起红细胞破裂。当机体免疫力下降或受到其他病原体侵袭时,附红细胞体大量增殖,变形的红细胞增多而不能及时通过脾脏、淋巴结及时被清除,逐渐出现贫血及黄疸。当免疫识别细胞进行自身识别时,将附红细胞体寄生的红细胞误认为是异种抗原,一方面加速机体内各类吞噬细胞(脾、淋巴结、肝、骨髓、脑、血液中以及肠系膜上的固定和游离的大、小吞噬细胞)吞噬这些附着附红细胞体的红细胞,从而加剧了贫血和血红蛋白尿的形成;另一方面导致机体产生自家抗体引起Ⅱ型过敏反应,产生自身抗体IgM型冷凝素并攻击被感染的红细胞,进一步引起自身免疫溶血性红细胞溶解,加重了贫血和血红蛋白下降。此外,由于附红细胞体大量繁殖,使代谢紊乱,血糖分解上升,引起低血糖。当病犬血清碱性磷酸酶、肌酸激酶和谷-草转氨酶活性升高,提示附红细胞体的感染已引起了广泛的组织器官损伤[22-23]。最终病犬生理生化值的改变以及部分组织器官严重损伤,导致机体代谢紊乱、酸碱失衡等严重后果,引起患犬死亡。

其二,附红细胞体的细丝状结构可嵌在红细胞的细胞膜上,使红细胞膜产生小而深的凹陷和变形,从而导致红细胞膜发生形态、结构和机能的改变[24]。这些变形的红细胞在经过脾脏和淋巴结时会被清除。在隐性感染的情况下,机体防御系统功能健全,正常的红细胞数之间保持一种动态平衡,附红细胞体在血液中的数量保持相当低的水平,机体不表现临床症状。在高强度的应激因素下,机体抵抗力下降,附红细胞体大量繁殖,使寄生部位糖代谢旺盛,变形的红细胞数量急剧增多。一方面,大量的变形红细胞被机体清除,从而导致贫血;另一方面,红细胞膜结构和形状的改变导致原先被遮蔽的抗原暴露出来或者已有抗原发生变化,引起自身免疫溶血性贫血,并且伴有血糖降低(与附红细胞体的感染程度成正比,但一般无异常的糖代谢机能障碍)、谷-丙转氨酶增高等血液生理生化指标的改变,以及肝功能损害、脑组织和心肌发生病理性损伤等广泛的组织损伤,导致代谢紊乱、酸碱失衡等严重后果,最终导致患犬死亡。

从以上两种说法来看,它们既有许多相同之处,又有许多不同之处,如对谷-草转氨酶或谷-丙转氨酶的表述,但有一点通过资料可知,犬附红细胞体致病机理的两种说法在很多方面都是推测,而且主要是参考了其他动物的研究成果,所以需要进一步深入研究。

4 临床症状和病理变化不典型

患附红细胞体病犬临床症状和病理变化不典型,而且多为隐性感染,很多犬病都有相似的临床症状和病理变化,如某些寄生虫性疾病、肝源性疾病、慢性消耗性疾病等,都可以引起犬体温升高、呕吐、腹泻、贫血、黄疸等症状,这给临床诊断和疾病防治研究带来了困难。患犬主要临床症状和病理变化表现如下:

急性患犬体温升高至40℃左右,脉搏、心跳、呼吸次数增加。四肢无力,精神沉郁,甚至卧地嗜眠。可视黏膜苍白或黄染。食欲不振,呕吐、长期腹泻或便秘交替、腥臭,常混有黏液或血液,被毛粗乱,皮肤弹性下降,呈现不同程度脱水症状,消瘦。隐性感染呈慢性经过,症状不明显,仅表现食欲不振,逐渐消瘦,慢性贫血。此外,母犬感染该病时多有发情期阴门流血时间长、屡配不孕、空怀、流产、弱胎、死胎等繁殖机能障碍。还有的报道有呼吸道症状[25]和神经症状[26]。病愈后可二次感染或反复感染。

自然感染犬脑、心、肺、肝、脾、肾、肠道等均表现溶血性病变。皮肤和可视黏膜苍白、黄染,皮下有出血点,有的皮下水肿;血液稀薄,不易凝固;肝肿大质硬,土黄色;胆囊充满胆汁,黏稠;脾肿大,质软,有的脾脏上有针尖大黄色坏死点;肺有气肿、肉变;淋巴结肿胀。心包积液,心肌似煮肉样;胸腹腔积液。

5 诊断研究还处在探索阶段

犬附红细胞体病的诊断目前还主要是借鉴其他动物的诊断方法,对犬是否有敏感性和特异性还有待进一步研究。由于患附红细胞体病的病犬临床症状和病理变化不典型,流行病学也没有独特的形式,而且多为隐性感染和需要鉴别诊断,所以犬附红细胞体病的临床诊断主要依据实验室检查。实验室检查主要包括血压片直接镜检法、血涂片染色镜检法、电镜观察、血清学检查,以及利用分子生物学技术等一些检查和诊断方法。

目前对于犬附红细胞体病的诊断,临床上多采用鲜血直接压片检查虫体。因为这种方法简单、快捷、不需要特殊设备等,但有人发现有些涂片阳性的病例并没发现病原,出现假阳性[27]。这是由于多种原因均可引起红细胞变形,使其表面或边缘出现突起,或锯齿状红细胞,棘行红细胞或一些红细胞碎片,误认为是红细胞表面附着的虫体。血涂片染色镜检法也是较常见的诊断方法,但缺乏特异性,往往需要与其他检查方法相结合确诊该病,才能提高检测的准确性,所以血压片直接镜检法、血涂片染色镜检法都不能确诊犬附红细胞体病。电镜观察需要昂贵的电镜,无法在基层推广。血清学检查目前普遍采用补体结合试验(CFT)、间接血凝试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光试验等特异性检验方法,其诊断结果确实并可作为流行病学调查,但主要用于对绵羊附红细胞体病和猪附红细胞体病的诊断,而且CFT法对急性病例诊断效果好,但慢性带菌者出现阴性反应,因此不适用于犬附红细胞体病的诊断;IHA法灵敏性高,能检出转阴后的耐过病畜,但从血浆中分离某些可溶性患犬附红细胞体抗原的过程复杂,需使用超滤细胞及分子筛色谱;ELISA法的敏感性也很高,但同样不适用于急性期诊断[2,28]。近年来国内外已建立DNA探针法[29]、PCR法[23,30-32]和定量PCR法[33]等分子生物学技术来诊断附红细胞体病。这些方法除了主要用于对其他动物附红细胞体病的诊断外,其中DNA探针法不宜用于疾病潜伏期附红细胞体感染的检测;PCR法程序复杂,需要较高的专业知识,不适合基层临床推广;定量PCR法作为检测附红细胞体感染的方法还处在研究阶段。这些新方法是否适宜于对犬附红细胞体感染进行检测还有待进一步研究。

6 犬附红细胞体的毒力和致病力都在增强

许多资料记载,犬附红细胞体通常毒力较弱,致病力不强,呈隐性经过,但从近几年的临床病例来看,犬附红细胞体的毒力和致病力都在增强,而且常呈显性经过,感染面积大,单纯感染即可引起犬死亡,如果继发其他疾病,危害更为严重。本病的隐性感染率极高,隐性感染的犬不仅在应激反应时会暴发,而且会与其他疾病并发给诊疗带来困难,并常引起病犬死亡。

例如,1999年1月,吉林省某种犬场仔犬突然发病307头,死亡230头,其发病率和死亡率分别为20%和74.9%,根据临床症状、流行病学、病理解剖和实验室诊断,确诊为犬附红细胞体病。同年10月份,辽宁省大连市畜牧兽医服务中心门诊在治疗犬病中,临床诊断发现有58例是由于感染了犬附红细胞体引起的。2005年6月2日,黑龙江省方正县刘某饲养的108头肉犬,其中45头相继发病,并确诊为犬附红细胞体病,发病率为41.7%,死亡 5头,死亡率为11.1%,其他犬由于治疗及时,才避免大量死亡。辽宁省锦州某养殖户养殖肉犬162头,于2006年8月开始,有28头肉犬相继出现高热、贫血、黄疸,后期出现以摇头为主的神经症状,至9月末有6头肉犬死亡,后确诊为犬附红细胞体病并及时进行了治疗;2009年6月,沈阳某警犬基地300余头警犬在例行常规检查时发现并确诊全部感染了犬附红细胞体,其中几头长期腹泻、消瘦、贫血,发情期阴门流血时间长、屡配不孕等犬经诊断也是由于感染了犬附红细胞体引起的,而且年初死亡的2头犬经推测也是由于感染了犬附红细胞体致死的。由于发现及时并采取了有效的防治方法,才避免了病情的进一步发展。

7 免疫问题研究较少

自1981年美国生殖学家Siegel提出“红细胞免疫系统”的新概念[34]以来,已证实红细胞具有识别、黏附、杀伤抗原,清除免疫复合物,参与机体免疫调节和自我调控作用,是机体免疫系统的一个子系统[35]。红细胞是机体清除抗原和循环液相中免疫复合物的主要承担者。测定红细胞表面的C3b受体及其免疫黏附能力,可作为评价动物红细胞免疫功能的主要指标。但关于犬附红细胞体对犬免疫水平的影响研究材料还很少,这方面的研究主要集中在猪等其他一些经济动物上。

李清艳等对急性附红细胞体病猪血液学和机体免疫功能进行了研究,研究结果表明,附红细胞体侵袭红细胞的同时,破坏了红细胞膜表面的C3b受体,红细胞膜表面游离状态的C3b受体数量明显减少,红细胞免疫黏附功能降低,不能完全将免疫复合物(IC)清除,大量IC沉积于血管内壁,造成血管内壁免疫性损伤,血管通透性增强,引起组织水肿、出血等一系列病理损伤。同时,红细胞膜表面的C3b受体的破坏,还会影响T淋巴细胞分化和成熟,使红细胞免疫功能和细胞免疫功能低下。延边大学的柴方红对猪附红细胞体是否影响仔猪的免疫水平做了研究。研究结果表明,与健康仔猪相比,猪附红细胞体病仔猪的红细胞Cb3受体花环率和CI花环率明显降低;淋巴细胞转化率、T淋巴细胞Ea花环率明显降低;B淋巴细胞EAC花环率明显降低;外周血中性粒细胞吞噬率及吞噬指数明显降低,而且差异均极显著。这说明猪附红细胞体对仔猪的红细胞免疫功能、细胞免疫水平、体液免疫水平及中性粒细胞功能均有明显的抑制作用。为进一步验证猪附红细胞体对仔猪免疫水平的影响,研究还对流行猪附红细胞体病的图们市某猪场的100头仔猪进行了猪瘟抗体水平检测。结果发现,感染猪附红细胞体仔猪的猪瘟疫苗整体免疫合格率(49.%2)明显低于健康仔猪(93.5%),且显性感染仔猪的免疫合格率(41.6%)低于隐性感染仔猪(53.5%)。证明了猪附红细胞体严重干扰了猪瘟疫苗的免疫效果,且干扰程度随猪附红细胞体感染程度的加深而更为明显。

红细胞免疫功能的破坏直接或间接地影响到整个免疫系统功能的协调。红细胞感染附红细胞体后,机体红细胞免疫功能降低,这可能是该病易引起其他病原体继发感染的免疫学理论依据之一。本病目前尚无疫苗,防制措施是搞好栏舍及环境卫生;驱除体内外寄生虫;搞好饲养管理,消除一切应激因素等。所以,犬附红细胞体感染免疫预防研究是我们今后应该深入研究的课题。

8 国内开展犬附红细胞体研究还不深入

从现在的研究状况上看,国外这方面的研究起步较早,研究也较多,但在很多方面的研究也不明确。我国对附红细胞体病的研究相对滞后,对犬附红细胞体病的研究更是如此,仅在临床症状、组织病理学变化、生理生化指标、基本诊断和治疗等方面作了一些初步的研究。由于犬附红细胞体病未引起大的流行,加上其常是隐性带菌感染,所以并未引起高度重视。但做为一种人畜共患病,应吸取SARS病出现时相关病原研究缺乏大量基础资料和资深专家的教训,再加上国内各种动物包括人在内发生此病的报道日渐增多,这在公共卫生方面应给予高度关注,并应投入一定的人力物力进行专门的深入研究。国内虽然对犬附红细胞体的研究取得了一定成果和进展,但对其微细结构与化学组成、病原学分类、生理代谢、体外培养方法、抗原免疫性及与免疫缺陷的关系等方面都还不十分清楚,有的方面甚至是空白,即使是生活史、发病机制、传播途径、附红体和红细胞的结合方式,以及病原与机体的相互作用等也有待进一步阐明和深入研究。此外,提高其防治水平,探索、开发特异性强、敏感、简易稳定的快速诊断方法以及建立分子生物学检验方法等也至关重要。

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