猪圆环病毒2型疫苗研究进展

黄红亮,邵定勇,罗满林,陈瑞爱

(广东大华农动物保健品股份有限公司,广东新兴 527400)

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaningmultisystem icwasting syndrome,PMWS)的原发病原,后来发现PCV-2还与猪皮炎与肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrom e,PDNS)、先天性震颤(Congenital termors,CT)、后期流产(Late-term abortions)和渗出性皮炎(Exudative epidermitis)等疾病密切相关,统称为PCV-2相关疾病。临床主要表现为生长迟缓、进行性消瘦、呼吸困难、黄疸、腹泻、皮炎、繁殖障碍、震颤等[1]。淋巴系统衰竭是PCV-2感染的特征性病变,导致机体的免疫抑制,易于诱发多种病毒及细菌的混合感染与继发感染。自1991年加拿大首次发生PMWS以来,PCV-2感染迅速在北美洲、南美洲、欧洲、亚洲、大洋洲和非洲的各个养猪国家蔓延。我国为养猪大国,PCV-2感染也相当严重,全国各大小猪场均存在PCV-2感染的报道[2]。可见,PCV-2已经成为阻碍当今养猪业发展的重要病原之一。疫苗免疫作为防控PCV-2的主要手段,国内外研究者正在着力研究与开发各种PCV-2疫苗。灭活疫苗与亚单位疫苗是早期研究的疫苗,已有2个灭活疫苗与2个亚单位疫苗在美国及欧洲注册上市,这些疫苗为当地PCV-2感染的控制发挥了重要作用,但免疫效果仍然有待进一步提高,我国目前没有任何相关疫苗注册上市。弱毒疫苗已进入临床试验,但病毒增殖能力、毒力返强等问题仍需要解决。随着分子生物学技术的发展,活载体疫苗、核酸疫苗等新型疫苗正在积极研究中,成为目前的主要研究热点。

1 PCV-2的基因结构

猪圆环病毒(PCV)是圆环病毒属的代表种,直径平均为17 nm,是迄今为止发现的一种最小的动物病毒。根据猪圆环病毒的致病性、抗原性及核苷酸序列的差异,PCV被划分为无致病性PCV-1和致病性PCV-2两个基因型。PCV基因组为单股环状DNA,PCV-1基因组全长为1 759 bp,PCV-2基因组全长为1 767 bp或1 768 bp,两者的同源性为68%～76%。PCV-2基因组共编码11个开放阅读框(open reading frames,ORFs),ORF1-ORF11,ORF1、ORF5、ORF7、ORF10位于病毒 DNA 链上,ORF2 、ORF3 、ORF4 、ORF6 、ORF8 、ORF9 、ORF11则由互补链编码,其中ORF1、ORF2是两个最大的阅读框,目前仅发现 ORF1、ORF2、ORF3编码蛋白,还未见有其他蛋白研究[1]。有研究表明ORF6/7/8可能与病毒复制有关,ORF3/4/5可能与病毒毒力相关,ORF11可能与病毒潜伏期有关,而ORF9/10则可能不存在或与病毒复制及毒力无关[3]。2个主要编码蛋白分别为由ORF1编码的与复制有关的Rep蛋白和由ORF2编码的衣壳蛋白Cap蛋白。2个基因型之间ORF1比较保守,同源性为83%,ORF2的同源性为 67%～70%。PCV DNA以滚环方式复制,ORF1与ORF2间的茎环结构TAGTATTAC(PCV-1)或 AAGTATTAC(PCV-2)为复制起点[4]。

2 PCV-2的主要蛋白

2.1 Rep蛋白

ORF1基因产生2个大小不同的共线性转录产物,分别编码 Rep蛋白与 Rep＇蛋白,Rep蛋白由312 aa组成,分子质量约为35 ku,Rep＇蛋白由168 aa组成,分子质量约为19 ku,两者都是病毒基因组复制必需的蛋白,且两者必须共同作用才能启动病毒的复制。ORF1基因在所有圆环病毒中高度保守,且功能上可以互相替代。在Rep蛋白中存在3个典型的滚环复制结构域酶起始复制基序:motifⅠ(FTLNN)、m otifⅡ(HLQG)和 motifⅢ(YCSK),位于解旋酶结构域的dNTPs结合基序(p环)或称为Walker A和Walker B,这些结构对于Rep蛋白与非编码区的茎环结构的结合和维持Rep蛋白的结构与功能都至关重要[3,5]。Rep蛋白存在有两个T淋巴细胞表位,分别位于第81位～100位和第201位～220位氨基酸[6],由于细胞免疫在PCV-2免疫保护具有一定的作用,Rep蛋白也具有免疫保护能力。

2.2 Cap蛋白

ORF2基因编码病毒的Cap蛋白,由基因组的互补链合成。Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白,由234 aa组成,分子质量约为28 ku。PCV-2与PCV-1 Cap蛋白之间虽然具有共同的抗原表位,但不存在交叉反应。经多肽扫描分析,Cap蛋白的第65 aa～87 aa,113 aa～139 aa和193 aa～207 aa为PCV-2型特异性的抗原位点,第169 aa～183 aa为PCV-1和PCV-2共有的抗原表位。Shang S B等利用Cap蛋白单克隆抗体鉴定了5个线性B细胞表位,231 aa～233 aa与 195 aa～202 aa为 PCV-2特异性,92 aa～103 aa为PCV-1特异性,156 aa～162 aa和179 aa～192 aa为两者共有,且利用中和抗体将PCV-2分为 3种抗原表型,即1766PCV-2、1767PCV-2与1768PCV-2[7]。另外,PCV-2 Cap蛋白的 47 aa～63 aa、165 aa～ 200 aa和230 aa～ 233 aa区域内 ,至少存在5个不同但彼此重叠的构象型抗原表位。目前发现的这些抗原表位主要为B细胞表位。研究证明,Cap蛋白为PCV的主要保护性免疫蛋白。

2.3 ORF3编码蛋白

尽管人们很早便知道ORF3基因的存在,但最近几年才对其功能有所研究。PCV-1和 PCV-2的ORF3分别编码由206个氨基酸和104个氨基酸组成的蛋白质,分子质量分别为23.2 ku和11.9 ku。ORF3为病毒复制非必需基因,经典途径诱导细胞凋亡,野生型 PCV-2较缺失ORF3的重组PCV-2导致更严重的病毒血症、淋巴结病理变化,T淋巴细胞明显减少,且病毒载量大,说明ORF3可能为PCV-2的另一个毒力因素[8-9]。但是,ORF3编码蛋白第31 aa～50 aa含有一个T淋巴细胞表位[6],说明其在免疫保护方面具有一定的作用。

3 PCV-2疫苗研究

3.1 灭活疫苗

PCV-2灭活疫苗无毒,安全,性能稳定。在国外有Merial公司研制的全病毒灭活疫苗Circovac,及Fort Dodge公司研制的PCV-1与PCV-2嵌合全病毒灭活疫苗Suvaxyn PCV-2 one dose。Circovac主要用于母猪免疫接种,其所产小猪母源抗体可在5周内抵抗PCV-2感染,也可用于保育猪、育肥猪的免疫接种,免疫后可以减轻病理组织损伤,降低死亡率。目前Circovac在欧洲许多国家均获得上市许可。Suvaxyn PCV-2 one dose在美国已获得完全许可,在加拿大已申请注册,主要用于仔猪免疫接种,激发的免疫反应不受母源抗体影响,可有效预防PCV-2病毒血症,减少淋巴组织损伤,降低仔猪死亡率[10]。在国内目前没有注册的PCV-2疫苗,但一些科研单位有PCV-2灭活疫苗研制。总体而言,灭活疫苗对机体刺激时间比较短,需多次接种,且效果不太理想;而且PCV-2在细胞上增殖滴度低,其制备费用远远高于其他疫病的灭活疫苗。因此,新型PCV-2疫苗研究成为趋势,包括基因工程疫苗和核酸疫苗等,以期降低疫苗成本,提高免疫效力。

3.2 亚单位疫苗

PCV-2 Cap蛋白被认为是主要免疫原性蛋白,且与PCV-1 Cap蛋白无交叉保护性,因此,国内外许多学者均将PCV-2 Cap蛋白单独表达以研制能有效防治PCV-2感染的亚单位疫苗。常用的表达系统为杆状病毒表达系统,利用杆状病毒在昆虫细胞中表达的Cap蛋白能自我组装成类病毒粒子,免疫动物后可诱导高水平的ELISA抗体及PCV-2特异性的淋巴细胞增殖反应。国外已注册的疫苗中两种亚单位疫苗为Intervet研制的 Porcilis PCV和Boehringer-Ingelhein研制的CircoFLEX。两者均为杆状病毒表达的Cap蛋白亚单位疫苗,两剂量的Porcilis PCV及单剂量的CircoFLEX免疫接种3周龄及以上商品猪,均能产生伴有中和抗体的体液免疫反应,能减轻病毒血症,减少淋巴结组织损伤及PCV-2病毒载量[10],对欧洲及北美的PCV-2的控制发挥了巨大作用。单剂量的Porcilis PCV同样能部分地抵抗PCV-2感染[11]。

3.3 减毒活疫苗

制备减毒活疫苗包括两种方法,一种为传统方法,即将病原体在非易感动物或细胞进行连续传代,导致病原体毒力降低;另一种为通过基因工程方法使毒力基因缺失或重组,获得减毒病原体。Fenaux M等[12]将 PCV-2分离株在 PK-15细胞中连续传至120代,发现第120代病毒(PCV-2 VP120)基因组中Cap基因发生了2个碱基突变,第110位的脯氨酸变为丙氨酸,及第191位的精氨酸变为丝氨酸。用PCV-2 VP120和PCV-2 VP1感染SPF猪,PCV-2 VP120感染后的病毒血症发生率低于PCV-2 VP1,且持续时间短,血清中 PCV-2基因组拷贝量、眼观病变及组织学病变也较 PCV-2 VP1感染猪轻,表明体外传代可增强PCV-2在细胞中的增殖能力,弱化其致病性,这为研制 PCV-2疫苗提供了一个新的思路。

无致病性PCV-1和致病性PCV-2基因组的同源性为68%～76%,且均具有2个主要开放阅读框ORF1与ORF2,分别编码与复制有关的Rep蛋白和构成衣壳的Cap蛋白,ORF1基因比较保守,同源性为83%。Fenaux M 等[13]将PCV-2的 ORF2替换PCV-1的ORF2,成功构建减毒的嵌合PCV-1和PCV-2,用 200μg嵌合病毒 DNA克隆及 103.5TCID50嵌合病毒分别免疫SPF仔猪,免疫后42 d,大部分免疫猪血清中PCV Cap蛋白抗体均发生阳转,在42 d用2×104.5TCID50 PCV-2野毒攻毒,21 d后在所有免疫猪均未检查到病毒血症,淋巴结肿大及衰竭明显减轻,淋巴结中病毒DNA及抗原量较对照组显著减少,且抗体阴性猪对PCV-2也具有相当的抵抗力,表明细胞免疫在保护性免疫方面具有重要的作用。Gillespie J等[14]对嵌合病毒进行2个氨基酸的标志性突变后在PK-15细胞连续传代11次,在猪体内连续传代3次,以鉴定其遗传稳定性,结果表明,在PK-15细胞传代后,并未发生遗传变异,而在猪体内传代时,如果存在压力,突变的氨基酸可能发生回复突变,不存在压力则不发生突变。由此可见,嵌合病毒是一个很好的候选疫苗。PCV-2 ORF3是最近发现的基因,ORF3蛋白能诱导感染细胞凋亡,与PCV-2的致病相关,Karuppannan A K等[9]利用酵母双杂交系统构建了ORF3突变的重组PCV-2,接种断奶仔猪后不引起明显的临床症状,与野毒相比,病毒血症、淋巴结病理变化及抗原载量明显减轻,且诱导了较强的抗体反应及细胞免疫应答,表明ORF3突变能显著降低PCV-2的毒力,且突变病毒能诱导更强的免疫应答,是PCV-2疫苗研究的一个新方向。

3.4 病毒载体疫苗

3.4.1 腺病毒载体 腺病毒载体是目前应用比较广泛的载体,由于其宿主范围广、感染性强、安全性高、外源病毒能游离表达等特点,用于制药、基因工程疫苗、基因治疗以及肿瘤治疗等领域。Wang X等[15-16]将PCV-2 ORF2克隆至转移载体pShuttle-CMV,构建重组质粒 pShuttle-CMV-ORF2,线性化pShuttle-CMV-ORF2与骨架载体pAdEasy-1共转染大肠埃希菌BJ5183获得重组质粒pAd-ORF2,线性化后转染293细胞获得重组腺病毒rA d-Cap。以108、1010、1012TCID50 rAd-Cap 免疫小鼠两次 ,用间接ELISA、Western blot及病毒中和试验均可在免疫鼠血清中检测到PCV-2ORF2抗体。用rAd-Cap两次免疫仔猪,间隔两周;首免后37 d,能检测到ELISA抗体及病毒中和抗体;攻毒后,免疫猪有短暂的发热,发热时间较攻毒对照组短,无其他明显的临床症状。祝卫国等[17]将ORF1、ORF2串联构建了同时含两个基因的重组腺病毒,免疫小鼠可以诱导抗体免疫应答。可见,重组腺病毒免疫显著减轻了免疫猪的病理变化及病毒血症,是有效的PCV-2候选疫苗。

3.4.2 伪狂犬病毒载体 猪伪狂犬病毒(PRV)是猪伪狂犬病(PR)的病原,PRV病毒基因组为线性双股DNA分子,约150 kb,至少包括70多个基因,其中含有大量的非必需基因,可以容纳较大片段的其它病原体保护性抗原基因的插入表达。Ju C等[18]将PCV-2 Yu-A株的ORF1与ORF2基因串联克隆入中间转移载体,与PRV TK-/gE-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞,获得重组伪狂犬病毒PRV-PCV-2,经鉴定 PRV-PCV-2能有效表达ORF1-ORF2,用PRV-PCV-2免疫 Balb/c鼠后,诱导了强烈的抗PRV与PCV-2的抗体反应,及PCV-2特异性的淋巴细胞增殖反应,免疫断奶仔猪后,诱导了强烈的抗PRV的抗体反应,但对PCV-2仅诱导了特异性淋巴细胞增殖反应而无抗体反应。Song Y等[19]通过将PCV-2 ORF2基因克隆到中间转移载体且与PRV TK-/gE-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞构建了能成功表达ORF2的重组伪狂犬病毒TK-/gE-/ORF2+,用该重组病毒免疫4周龄仔猪,可诱导对PRV与PCV-2的体液免疫反应,在免疫后49 d可以检测到PCV-2特异性的淋巴细胞增殖反应。

3.4.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒载体 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是猪繁殖与呼吸综合征的病原,可引起母猪怀孕后期流产及小猪的呼吸道疾病,为单股正链 RNA病毒,Pei Y等[20]在PRRSV cDNA克隆的ORFs 1b与2a插入两个限制性酶切位点及一个转录调节序列,将其改造成一个病毒载体,然后将PCV-2 ORF2基因插入两个限制性酶切位点间,由插入的转录调节序列启动转录,转染 Marc-145细胞获得了 P129-PCV重组PRRSV,两次免疫仔猪,首免后3周内,母源抗体存在,抗体水平不断下降,而二免后1周,免疫猪产生了PCV-2特异性的抗体应答,结果表明PRRSV能成功表达猪其它病原的免疫原性蛋白,并诱发特异性的免疫反应,可以作为表达外来病原的猪疫苗载体。

3.4.4 杆状病毒载体 杆状病毒是一种对哺乳动物细胞的基因转移载体,其基因组进入细胞后,可以诱导靶基因的瞬时表达,该系统操作简单、无毒性、宿主不产生抗杆状病毒的抗体。Fan H等[21]将PCV-2 ORF2克隆入杆状病毒基因组CMV启动子下游,转染昆虫细胞后获得重组杆状病毒(BV-GORF2),Western blot及流式细胞仪检测结果表明BV-G-ORF2在哺乳动物细胞中能有效表达Cap蛋白,且水疱性口膜炎病毒糖蛋白(VSV-G)能增强病毒进入哺乳动物细胞的能力,以 1×108或1×109PFU剂量免疫小鼠,能诱导PCV-2特异性ELISA抗体、中和抗体及细胞免疫反应,即使1×108PFU免疫,较表达Cap蛋白的DNA表现更强的免疫原性,结果表明,假型杆状病毒可用于新一代PCV-2疫苗研究。

3.5 细菌载体疫苗

3.5.1 乳酸菌载体 乳酸菌在食品发酵业的应用具有悠久历史,是安全的口服细菌。以乳酸菌作为活疫苗载体,靶向表达医用蛋白和抗原物质,已成为医药研究领域的热点之一。Wang K等[22]将PCV-2 ORF2克隆入E.coli/L.lac分泌型穿梭表达载体pSEC:LEISS,构建了重组穿梭载体pSEC:LEISS-dCap,电转化乳酸菌NZ9000,获得能有效表达Cap蛋白的重组乳酸杆菌NZ9000/pSEC:LEISS-dCap,该重组乳酸杆菌能耐受60 g/LN aCl浓度的高盐环境和pH 1.5～4.5的胃液环境,在人工肠液中出现较明显的生长趋势,但对胆酸盐耐受力较差,以NZ9000/pSEC:LEISS-dCap培养液经口灌喂对Balb/c小鼠的生长发育没有影响,无毒性作用,能够诱发小鼠产生抗Cap蛋白的特异性IgG抗体,刺激肠道黏膜淋巴组织对其产生黏膜免疫。因此,NZ9000/pSEC:LEISS-dCap作为疫苗制品具有很大的应用和开发潜力。

3.5.2 德特氏菌载体 支气管炎博德特氏菌很容易在呼吸道黏膜定植,可能是一种比较好的能递送异源蛋白至哺乳动物甚至人呼吸道的活载体。Kim T等[23]将PCV-2的ORF2克隆至aro A突变的支气管炎博德特氏菌获得表达主要衣壳蛋白的重组博德特氏菌(BBS-MCP),然后用重组细菌鼻内免疫小鼠和猪,用ELISA均可在血清中检测到MCP的抗体,用PCV-2攻毒后,在活BBS-MCP免疫的猪淋巴结中检测不到PCV-2 DNA,结果表明BBS-MCP免疫能有效抵抗PCV-2的感染,是发展抗PCV-2感染的减毒活疫苗的又一选择。

3.6 类病毒粒子载体疫苗

类病毒粒子是一种非复制型的载体,主要由病毒的衣壳蛋白自我组装而成,如细小病毒(PPV)的衣壳蛋白在表达后可以自我组装形成类似PPV的颗粒。近年来,这种类病毒粒子用来携带其他病原的抗原表位而诱导免疫应答,抵抗相应的疾病,是一种新兴的疫苗载体。Pan Q等[24]将PCV-2的抗原表位克隆到PPV VP2基因,VP2基因被克隆到腺病毒载体使其表达获得杂合的类病毒粒子[PPV∶VLP-(PCV-2)],在没有任何佐剂的条件下,PPV∶VLP-(PCV-2)较重组腺病毒表达的PCV-2 ORF2能诱导更强的体液免疫应答,可见 PPV∶V LP-(PCV-2)是可以预防PPV与PCV-2共感染的一种新兴疫苗。

3.7 核酸疫苗

核酸疫苗因高效、持久、广谱、简便、廉价、无致病性等特点,被作为一种新型的疫苗而得到广泛的研究。将含PCV-2 ORF2基因的DNA疫苗载体免疫动物后能诱导PCV-2抗体阳转。为了增强PCV-2DNA疫苗的免疫效果,通常将免疫佐剂,如CpG基序[25],与PCV-2 ORF2共同克隆入DNA疫苗载体构建DNA疫苗,结果表明免疫佐剂能一定程度地增强DNA疫苗的免疫效应。另外,将分别含ORF1、ORF2、ORF3的DNA载体联合免疫可以增强免疫效果。A ravindaram K等[26]用p3224-ORF-1,-2和-3单独或联合免疫Balb/c小鼠2周后,用相应的重组安哥拉牛痘病毒加强免疫,发现ORF-2/-3与ORF-1/-2/-3两种组合免疫诱导的IFN-γ、TNF-α、GM-CSF及PCV-2抗体水平均较其它免疫组高,尽管所有免疫组主要诱导体液免疫,而ORF-2/-3与ORF-1/-2/-3两种组合免疫后的细胞免疫水平显著高于其他组,攻毒后这两种组合免疫显著减轻了免疫鼠的肺部病变。Fan H等[27]通过构建四种不同Cap蛋白定位的DNA疫苗载体探讨了DNA疫苗免疫及Cap蛋白的定位对诱导免疫应答的影响,结果表明,四种DNA疫苗免疫均能诱导PCV-2特异性的体液免疫,但分泌型Cap蛋白较膜定位、核定位及胞质Cap蛋白诱导更高的中和抗体,且降低了IFN-γ水平,而膜定位Cap蛋白则使IFN-γ升高,由于 IFN-γ能促进 PCV-2的复制,当PCV-2感染时,DNA疫苗免疫诱导的高水平IFN-γ存在潜在的危险,因此,表达分泌型 Cap蛋白的DNA疫苗是比较好的选择。

4 小结

在北美及欧洲已有PCV-2灭活疫苗与亚单位疫苗注册上市,这些疫苗对该地区PCV-2的控制发挥了巨大的作用。由于灭活疫苗用增殖能力低的PCV-2全病毒制备,表达亚单位Cap蛋白的杆状病毒需用昂贵的昆虫细胞培养系统,因而这些疫苗的生产成本较高,而且诱导的免疫应答主要为体液免疫,忽视了细胞免疫应答在PCV-2保护免疫中的作用。减毒活病毒疫苗虽然能诱导更强的免疫应答,包括细胞免疫,但该疫苗的长期使用存在返强的危险,且增殖能力较低。因此,寻找成本低、能充分诱导体液免疫与细胞免疫的活病毒载体或活细菌载体是目前研究的重点,核酸疫苗也被广泛的关注。我国现在没有自主研发的疫苗注册,但已广泛开展了PCV-2疫苗的研究工作,积累了丰富的经验。相信随着生物技术的发展及对PCV-2不断深入了解,在不久的将来,我们一定能找到控制PCV-2的有效方法。

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