卵黄免疫球蛋白的性质与特点

史同瑞,黄宇翔,苏永福

(黑龙江省兽医科学研究所,黑龙江齐齐哈尔 161006)

当禽体受到特定抗原的刺激后,会产生相应的特异性免疫抗体,其中,机体产生的IgY抗体会从血液中大量主动转运至卵黄中,这种贮存于卵黄中的抗体称为卵黄免疫球蛋白(yolk immunoglobu lin,IgY),亦称卵黄抗体(yolk antibody)[1]。自1893年K lem perer等首次报道鸡蛋中存在抗体以来,现已就卵黄抗体的形成、结构特性、制备与提取方法,以及在疾病诊治中的应用等方面进行了较为深入的研究,并取得了显著的成果[2]。目前,有关卵黄抗体的研究已成为一个非常热门的研究领域,现有研究已经证实,卵黄抗体是一种新型、高效的绿色制剂,对诊断、预防和治疗细菌和病毒引起的疾病具有良好的作用。本文就卵黄抗体的形成、结构特点、理化和生物学特性及其作用机理作一综述。

1 卵黄抗体形成

禽类的免疫系统包括细胞免疫和体液免疫两部分,并分别受胸腺和法氏囊的控制。禽体内主要存在3种免疫球蛋白,即IgG、IgM 和 IgA,其中 IgG是禽的主要免疫球蛋白。研究表明,由于禽IgG的特性与哺乳动物的IgG存在着许多差异,因而通常将禽IgG称作IgY[3]。

在家禽受到外源抗原的刺激后,外源抗原能够刺激法氏囊的B淋巴细胞分化形成浆细胞,并分泌特异性抗体进入机体血液循环。当血液流经卵巢时,由于卵黄膜表面存在着密集的免疫球蛋白受体,所以流经输卵管血液中的特异性抗体,其中主要是IgY,便与卵黄膜上的受体结合,然后通过主动运输从血液中大量转运至卵黄中,并在卵黄中大量蓄积,形成卵黄抗体,卵黄抗体的转运量与血清中的IgY浓度有关。当卵细胞运行至输卵管时,流经输卵管血液中的特异性抗体,主要是IgM和IgA,进入卵清中,形成卵清抗体。与卵黄抗体相比,由于卵泡在输卵管中移行时间较短,同时加之生理特性等原因,因而蛋清中的抗体含量极微,且蛋清中的免疫球蛋白主要是IgM 和IgA[1-2,4]。在禽胚孵化过程中,卵黄抗体逐渐进入禽胚血液中,为新生雏提供被动性免疫保护,在雏禽疾病预防中具有重要作用。

2 IgY结构特点

禽IgY的结构与哺乳动物的IgG相似,均具有典型的空间构象,均能与抗原相结合,然而在某些方面禽IgY与哺乳动物IgG也存在差异。禽IgY也是由两条轻链(2L)和两条重链(2H)组成,分子质量一般比哺乳动物的IgG大,为180 ku。每条轻链的分子质量为22 ku～30 ku,较哺乳动物IgG的30 ku小,每条重链的分子质量为65 ku～70 ku,较哺乳动物的50 ku大。哺乳动物IgG的重链(γ)由1个可变区(VH)和3个恒定区(Cγ1～Cγ3)组成,Cγ1与Cγ3之间为绞链区,此区赋予Fab片段较大的灵活性,而禽IgY重链(υ)除 1个可变区外,还有 4个恒定区 ,即 Cυ1～ Cυ4,无铰链区[3,5-6]。

禽IgY的沉淀系数为7 S,等电点为5.2,含氮量为14.8%。研究表明,禽IgY的疏水基团多于哺乳动物的IgG,比较IgG和IgY的C-端序列发现,在基因序列上,IgG的Cγ2区和Cγ3区分别与IgY的Cυ3区和Cυ4区相似,而哺乳动物的IgG缺失类似禽IgY的Cυ2区,取而代之的是绞链区。序列比较分析同样发现,相对于其他免疫球蛋白IgA、IgM和IgD而言,禽IgY与哺乳动物的IgE在系统发生学上更接近一些[7-9]。

3 IgY理化性质

禽IgY与哺乳动物的IgG相比,由于存在结构的差异,所以稳定性较好,具有耐热、耐酸、耐碱和一定的抗酶降解能力。禽IgY具有良好的耐热能力,能够耐受巴氏消毒,在温度达到65℃时,IgY的活性可保持24 h以上,70℃加热90min后活性下降。IgY的稳定性比兔血清IgG稍低,IgY的变性温度是73.9℃,兔血清为77℃。在温度低于75℃条件下,IgY具有良好的热稳定性,如在4℃环境贮存5年,或在室温贮存半年,或在37℃环境贮存1个月,IgY活性基本无明显改变。将IgY溶解于生理盐水中,在4℃环境贮存6年～7年,其抗体活性降低不超过5%[10-11]。

禽IgY具有耐高渗性能和良好的耐反复冻融特性,在60%高浓度蔗糖溶液中仍有活性。IgY耐酸碱性较好,在pH 4.0～11.0范围内比较稳定,在pH 3.0～3.5范围时活性迅速下降,在pH 12.0时活性有所下降。经1∶20稀释的IgY与1mol/L盐酸作用30 min,其活性降低50%,作用 60 min活性才完全消失。禽IgY对胃蛋白酶有较强的抵抗力,但对胰蛋白酶较为敏感。在pH 2.0条件下,将胃蛋白酶与IgY混合温育1 h,活性基本丧失,但在pH 4.0条件下温育1 h,可保持91%的活性,温育10 h后仍可保持63%的活性。将IgY分别与胰蛋白酶和胰凝乳酶温育8 h,活性分别保持39%和41%。在pH 4.0左右的胃内酸性条件下,IgY滞留4 h后,其活性降至50%左右[7-8,12]。

禽IgY生物学特性独特,IgY与相应抗原形成的免疫复合物不能激活哺乳动物的补体系统,不与哺乳动物细胞的Fc受体、人抗鼠抗体、葡萄球菌蛋白A(SPA)和葡萄球菌蛋白G(SPG)结合,也不能与哺乳动物的类风湿因子(RF)发生反应[2,13]。

4 IgY作用机理

卵黄抗体预防和治疗疾病的过程是免疫反应的过程,其作用机理主要是IgY与病原的特定黏附因子发生特异性结合,从而导致病原丧失致病性。IgY能够黏附在特定病原的细胞壁上,改变病原的完整性,抑制病原的生长;IgY也能黏附在特定病原菌的菌毛上,排斥细菌黏附于肠道黏膜的上皮细胞,抑制病原菌的定殖[14]。大肠埃希菌、沙门菌等病原首先需要黏附于动物肠道黏膜细胞上,才能增殖,产生毒素,并感染动物。研究证实,抗大肠埃希菌卵黄抗体防治仔猪腹泻的作用机理有两种:一是卵黄抗体与大肠埃希菌的黏附因子结合,阻止大肠埃希菌黏附于小肠黏膜;二是卵黄抗体可直接与小肠黏膜的受体结合,阻止了大肠埃希菌黏附因子与小肠黏膜的结合[15]。用分离提纯的特异性菌毛抗原,制备抗产肠毒素大肠埃希菌卵黄抗体,体外黏附试验表明,效价为1∶640和1∶1 280的卵黄抗体显著抑制了K 88ae对肠上皮细胞的黏附作用,平均每个上皮细胞分别黏附8.5和2.4个细菌,而空白对照组平均每个上皮细胞黏附l6.4个K 88ae,二者差异极显著[14]。

口服卵黄抗体时,部分卵黄抗体在肠道消化酶的作用下,能够降解为可结合的片段,这些片段含有抗体的可变小肽(Fab)部分,小肽很易被肠道吸收,进入血液循环,并能与特定的病原黏附因子结合,使病原不能黏附于易感细胞而失去致病性。这些小肽还能与宿主血液中的球蛋白末端相结合,使其免遭机体破坏。IgY在肠道降解后形成的IgY稳定区(Fe)则存留在肠道内发挥作用[2,16-17]。

5 卵黄抗体的优点

5.1 产量高,成本低,易于生产

卵黄抗体来源于禽蛋,家禽易于饲养管理,产蛋多,费用适宜,饲养不受地域和季节的限制,这均为制备大量的卵黄抗体提供了经济、丰富的来源。与从动物血液中提取抗体的传统方法比较,从卵黄中提取IgY更为便捷,对动物也无损伤,简便易行。试验证实,卵黄中免疫球蛋白的含量一般为3mg/mL～25 mg/mL,一只商品蛋鸡年产蛋大约300枚,每枚蛋蛋黄大约为15 mL,每只鸡每年能提供大约15 g～100 g的IgY抗体[5,18]。研究结果表明,不同品系母鸡所产蛋的IgY含量也不相同,这就意味着有可能通过遗传选育高产品系鸡来提高IgY产量[4-5]。

由于禽类与哺乳动物种系差距大,当用禽生产抗哺乳动物组织成分的抗体时,可以用较少的抗原,产生较多的抗体,且免疫家禽卵黄中的IgY滴度能长时间维持较高水平,因此,禽类更适于用来生产抵抗哺乳动物病毒和细菌性疾病的特异性卵黄抗体。卵黄抗体的制备与提取方法较为简便,纯化的抗原经口服、注射等途径强化免疫家禽,待卵黄抗体达到理想效价后收集卵黄,经提取后即可得到粗制IgY。卵黄抗体能制成液体、粉剂等剂型产品,制备方法简单,成本低,可规模化生产[19]。

5.2 作为诊断试剂,具有较高的敏感性

抗原与免疫动物的亲缘关系越远,越易被机体识别,产生的免疫应答反应也越强。由于禽类与哺乳动物的亲缘关系甚远,所以哺乳动物的蛋白质抗原在禽体内更易产生特异性较强的免疫抗体,与IgG比较,IgY能够识别更多哺乳动物蛋白的抗原表位。许多高度保守的抗原,虽在哺乳动物中仅产生微弱的免疫原性,但也可用IgY进行区分,因此,IgY可应用于更多哺乳动物疾病的监测和诊断中[10]。

禽IgY独特的生物学特性,决定其在免疫检测中具有很大的应用潜力。在检测试验中,补体系统激活后,能影响抗原与特异性抗体的结合,导致产生假阴性结果,从而影响免疫检测的准确性。与哺乳动物IgG不同,IgY不能激活哺乳动物的补体系统,因此可提高诊断方法的准确性。在ELISA试验中,如用IgG包被微量检测板,哺乳动物血清中被活化的补体可与抗体结合,从而抑制了特异性抗原与抗体的结合,而采用IgY包被检测板作为捕获抗体,就不会激活标本中的补体系统,避免出现假阴性结果[9,20-22]。此外,与IgG相反,由于IgY不与哺乳动物的类风湿因子(RF)结合,同时也不能与哺乳动物Fc受体、葡萄球菌蛋白A(SPA)、葡萄球菌蛋白G(SPG)发生非特异性反应,因此,使用IgY可以避免由抗哺乳动物IgG抗体引起的干扰作用,不能导致假阳性结果的产生,IgY作为诊断试剂特异性更强,灵敏度更高[7,23-24]。如因粪便中的SPA和SPG含量很高,所以IgG不能用于检测粪便样本,而用IgY则不受影响。然而IgY与IgG相比,在结构上不易发生改变,也就不能有效地凝集抗原,因此,为了达到与IgG同样的凝集效果,则需要较多的IgY,而这会增加试验的成本[5]。

5.3 疗效高,无毒副作用

卵黄抗体具有较高的免疫活性。作为预防和治疗药物,可直接与相应的抗原发生快速免疫反应,具有作用迅速、疗效确切等优点。卵黄抗体治疗疾病是一种免疫学反应过程,抑杀病原具有特异性,不会产生耐药菌,避免了使用抗生素杀死有益微生物,导致机体微生态失调,产生耐药菌株,引起继发感染的副作用。卵黄抗体是禽蛋中存在的一种天然蛋白质,发挥作用后即可被机体作为营养物质分解利用,无副作用,不会残留有害物质[17,25-26]。

5.4 性质稳定,便于保存和使用

卵黄抗体作为一种具有生物活性的免疫球蛋白,在贮存、生产、加工和应用过程中,保证其稳定性是非常关键的。研究证实,卵黄抗体具有理想的稳定性,能够耐热、耐酸、耐碱和一定的抗酶降解能力。试验表明,用人工胃液消化卵黄抗体,在胃液含量较少的情况下,卵黄抗体效价基本无变化,虽然胃液含量高时影响较大,但在动物体内,胃液与食物的比例一般不超过1∶3,因此,实际应用时,胃液对卵黄抗体效价的影响并不大。由于卵黄抗体对胃蛋白酶具有一定的抵抗力,因此,既可经口服途径使用,也可经肌内注射使用。卵黄抗体耐热性能良好,可制成粉剂、液体制剂、冻干品等剂型,从而易于制剂的保存和运输[9]。

卵黄免疫球蛋白是一种来源丰富、性质稳定的多克隆抗体,具有稳定、安全、高效、无毒副作用等优点,是诊断和防治疾病的理想制剂。随着人们对卵黄抗体认识和研究的不断深入,卵黄抗体将具有广阔的开发应用前景。

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