DNA损伤修复基因与放射性肺损伤研究进展*

周 芊综述，杨镇洲审校

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所肿瘤中心，重庆 400042)

恶性肿瘤严重威胁着人类的生命健康。胸部肿瘤约占恶性肿瘤的35%～45%，放射治疗是胸部肿瘤最主要的治疗手段之一，而放射性肺炎(radiation pneumonitis，RP)作为胸部肿瘤放疗常见的严重并发症和剂量限制因素，其发生率达5%～15%，一旦发生，通常引起严重的临床后果[1]。不同个体接受放射治疗后放射性损伤的差别很大，遗传学和分子生物学研究提示，个体基因型差异和基因变异与放射性损伤相关。本文就目前有关放射性肺损伤的发生机制以及DNA损伤修复基因在其中的作用进行综述。

1 放射性肺损伤发生机制

放射性肺损伤表现为早期的放射性肺炎和后期的放射性肺纤维化。以往认为早期放射性肺炎的靶细胞为肺泡Ⅱ型细胞、血管内皮细胞，靶细胞及微血管的损伤为其发病的主要机制[2]，但伴随分子生物学技术的发展，人们逐渐认识到单一的靶细胞或靶组织受损观点难以解释放射性肺损伤过程的动态变化。目前认为肺的辐射敏感亚单位为肺泡/毛细血管复合体，放射性肺损伤表现为弥漫性肺泡受损。放射诱导的活性氧直接作用于实质细胞并由此改变细胞因子的微环境从而启动一系列“分子级联”反应;随着活性氧自由基的增多，导致脂质过氧化、DNA和蛋白质的氧化以及致炎因子的进一步激活，最终导致肺纤维化[3-4]。

大量研究证实，转化生长因子-β(TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、表面活性物质载体蛋白和细胞黏附素分子(ICAM-1、E-选择蛋白)在放射性肺损伤的发生中起着重要作用[5-6]。国内外学者对这些生物标志物进行了大量研究，尤其TGF-β1，目前公认其血浆中水平可作为放射性肺损伤的预测因子。Kim等[7]测定了34例肺癌患者放疗前、放疗起始、放疗中、放疗结束时及结束后2周、4周 6个时限点血浆 TGF-β1水平发现，发生放射性肺损伤患者，在放疗过程中TGF-β1降低，放疗结束时开始升高，结束后 4周血浆 TGF-β1水平明显高于未发生放射性肺损伤患者。

TGF-β分子质量为25 k D，由两个12.5 k D亚基通过二硫键连接而成，共有5种同分异构体及5种细胞膜受体，可调节细胞生长、分化。TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体是其主要的信号转导受体，TGF-β1与Ⅰ 、Ⅱ型受体的亲和力又比 TGF-β2大10～80倍。TGF-β首先与其Ⅱ型受体结合，再与Ⅰ型受体结合，然后通过多个环节和机制导致细胞外基质(ECM)过度积聚和纤维化发挥生物学作用:(1)刺激ECM产生细胞合成大量ECM，如Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型胶原和非胶原糖蛋白等;(2)通过抑制ECM降解酶，如基质金属蛋白酶(MMPs)、纤溶酶原激活物(PA)活性，增强这些降解酶抑制物的活性，从而减少ECM降解;(3)促进ECM 产生细胞表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)并使其活化而发生表型转化为肌成纤维细胞(MFB)，后者能合成和分泌大量胶原成分;(4)增加 ECM受体如整合素的表达，从而促进ECM与细胞间的相互作用。TGF-β还可与其他细胞因子如PDGF、IL-1等协同发挥生物学效应。

IL-1是由单核巨噬细胞合成分泌的一种前炎症细胞因子，有IL-1α和IL-1β2种亚型，在组织急性损伤中起重要作用。IL-1能诱导其他炎症细胞因子、趋化因子、黏附分子、急性期蛋白和组织蛋白酶等的合成，对嗜中性粒细胞、巨噬细胞具有趋化和促进释放炎症介质作用。PDGF是由A链和B链组成的二聚体，分为 AA、AB和BB 3个亚型，通过靶细胞膜上的PDGF受体发挥作用。PDGF能刺激间叶来源的细胞分裂、生长，是纤维母细胞的有丝分裂原，并能促使纤维母细胞转化为MFB及介导MFB表达αⅠ胶原基因，能使静止期的G0细胞进入G1及S1期。TNF为一种多功能性多肽，在炎症和免疫过程中具有重要调节作用，有 TNF-α和 TNF-β2种亚型。TNF-α与其受体结合可刺激多个信号转导途径，引起多种转录因子、细胞因子、生长因子、受体、细胞黏附因子等炎症及急性期蛋白表达。

2 DNA损伤修复基因

细胞受到照射后，DNA分子将产生多种类型的损伤，包括碱基错配、修饰、脱嘌呤或脱嘧啶位点形成、DNA单链、双链断裂以及DNA蛋白质交联等。由于体内存在DNA损伤修复系统，损伤的DNA就能被体内多种参与DNA损伤修复基因及其编码的酶所识别并通过多条途径进行修复。DNA损伤修复途径包括碱基切除修复(BER)、DNA双链断裂修复(DDSBR)、核酸切除修复(NER)和错配修复(MM R)4类，而电离辐射导致的DNA损伤主要是碱基损伤和DNA链断裂[8]，故涉及的DNA损伤修复途径主要是BER和DDSBR。

2.1 BER BER途径在短小DNA片段损伤修复中起主要作用。单功能DNA糖基酶通过水解碱基和脱氧核糖的糖苷键切除受损碱基，并留出一个无碱基位点，即无嘌呤/无嘧啶(AP)位点，随后在脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)帮助下切开DNA骨架，暴露游离的 5′-末端脱氧核糖磷酸盐(d RP)和3′-羟基[9]。双功能 DNA糖基酶(如 OGG1和 NEIL1)具有糖苷酶和AP裂解酶活性，能通过一个3′脱氧核糖磷酸基团和一个5′磷酸盐形成一个无碱基位点，APE1水解这个3′脱氧核糖磷酸基团后变成3′羟基，Polβ与之结合。哺乳动物细胞中，Polβ连接已切开的DNA骨架，并且该聚合酶的脱氧核糖磷酸裂解酶结构域能去除5′脱氧核糖磷酸，再根据Watson-Crick碱基互补原则填补无碱基位点，最后由 DNA连接酶Ⅲ/XRCC1复合物将其连接，整个损伤修复过程完成[10]。另外，NEIL1/2 DNA糖基酶也能激活碱基切除修复途径，并能切除受损碱基和同时暴露3′和5′端游离的磷酸[11]。多核苷酸激酶(PNK)切除3′磷酸，DNA Polβ连接受损位点并通过互补的核苷酸填补缺口，XRCC1/DNA连接酶Ⅲ再连接已切除的DNA骨架。因此碱基切除修复涉及的相关基因为h OGG1、APE1/Ref-1及XRCC1。

2.1.1 h OGG 1基因 8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(8-oxoguanine DNA glycosylase，OGG1)基因位于人染色体 3p26.2，由7个外显子和6个内含子组成，其等位基因在这个区域的缺失将导致产生肿瘤。OGG1基因启动子TATG和终止子TGA序列分别位于第1和第7外显子，对其启动子序列分析发现存在两个CpG岛，无TATA或是CAAT盒，这个结果说明h OGG1基因是一个看家基因，能在细胞周期中持续表达。OGG1是hOGG 1基因表达产物，同时具有糖苷酶和AP裂解酶活性，属于单碱基切除修复酶，最主要功能是修复DNA氧化损伤和其他修复基因共同维护DNA稳定性。人OGG 1细胞表达OGG 1α和OGG 1β2种不同亚型，OGG1α在细胞核和线粒体中均有表达，但OGG 1β仅表达于线粒体2种亚型共享起始的316个氨基酸，不过C末端完全不同。研究发现，重组 OGG1β蛋白无DNA糖基酶活性。电离辐射可以通过直接电离和ROS的间接作用致伤DNA，导致DNA单链和(或)双链断裂从而引起细胞死亡。OGG 1能识别并清除由活性氧攻击DNA氧化产生的8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHd G)，防止复制时G/A错误配对，造成子细胞由G/C到A/T的突变。若hOGG1失活或被人工敲除，使细胞修复8-OHdG能力降低或丧失，该细胞内遗传物质的突变率将比野生型高50倍，因此，h OGG1在DNA氧化损伤修复过程中起着重要作用[12-13]。

目前多数研究表明，OGG1受2种转录因子调节:(1)INF-γ通过特异性识别一个CCAAT盒模序调节h OGG1表达[14];(2)通过真核基因表达中重要的锌指转录因子Sp1调节hOGG 1表达。Youn等[15]发现镉可通过抑制Sp1活性而下调人OGG 1转录，但 Bravard等[16]研究发现，镉能可逆性抑制胞内h OGG 1活性，而其抑制纯化的h OGG1活性在加入EDTA后不能恢复。

2.1.2 APE1/Ref-1 人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原 因 子(apurinic/aprimidinic endonuclease/redox factor-1，APE1/Ref-1)基因位于14号染色体q11.2～12，含4个内含子和5个外显子，共2.6 kb。APE1/Ref-1启动子约300 bp，位于Cp G岛区，无 TATA盒，CCAAT盒和Sp1能够影响其基础转录水平，氧化应激后cAMP应答元件(CRE)可上调 APE1/Ref-1转录水平。启动子上游含有1个A型负性钙反应元件(n Ca RE-A)序列和2个B型负性钙反应(n CaRE-B)序列，故APE1/Ref-1可通过与自身启动子结合抑制转录，从而进行自身调节。APE1/Ref-1蛋白含318个氨基酸，相对分子质量为36.5 k D，其N端包含一个核定位信号区(NLS)主要通过Cys65发挥氧化还原功能，而C端在DNA无碱基位点发挥修复酶活性。研究发现，Cys65突变后APE1/Ref-1蛋白无氧化还原活性，但并不影响其修复功能，而DNA修复途径所需的各种氨基酸突变也并不影响其氧化还原功能，因此认为APE1/Ref-1的氧化还原和修复功能能各自独立发挥作用[17]。APE1/Ref-1的修复功能可使氧化损伤所致的有丝分裂后期不分裂细胞存活，E3330是一种苯醌和萘醌的类似物，可选择性抑制APE1/Ref-1氧化还原活性进而抑制细胞增殖[18]。新近体内外研究显示APE1/Ref-1还可作为一种核糖核酸内切酶剪切c-myc CRD RNA中的特定序列[19]。

APE1/Ref-1蛋白的转录后修饰形式有磷酸化、氧化还原、乙酰化及蛋白水解作用等。APE1/Ref-1蛋白磷酸化位点分散在整个分子中，这些可能的潜在磷酸化位点包括酪氨酸激酶Ⅰ和Ⅱ(CKⅠ和CKⅡ)、蛋白激酶C(PKC)以及糖原合酶激酶3(GSK 3)等蛋白的共有序列。早期的在体试验研究证实APE1磷酸化在由烷化剂导致的AP-1激活中起重要作用[20]，但目前对APE1磷酸化的作用机制尚不清楚。二硫键还原酶硫氧还蛋白(TRX)通过其活性中心的Cys35、Cys32与APE1/Ref-1氧化还原敏感位点Cys65相互作用，修饰APE1/Ref-1的氧化还原。这种T RX介导的APE1/Ref-1氧化还原调控作用需要p53和AP21的活化。APE1/Ref-1乙酰化由 Lys6和Lys7的P300乙酰化转移酶调节，可增强其对nCa RE序列的DNA结合能力，从而激活 PT H启动子[21]。组蛋白去乙酰化酶(H DAC)Ⅰ型可与APE1/Ref-1结合，而Ⅱ型不能结合，Ⅲ型HDAC能调节APE1/Ref-1乙酰化。SIRT1为Ⅲ型HDAC，最近Yamamori等[22]发现SIRT 1能使APE1/Ref-1去乙酰化、促进APE1/Ref-1与XRCC1结合、激活胞内AP内切酶活性，同时部分APE1/Ref-1可以介导SIRT1的细胞保护作用，故认为APE1/Ref-1是SIRT 1作用的靶蛋白，并且SIRT 1在通过调节碱基切除修复途径维持基因组完整性中起重要作用。此外，有研究发现，乙酰化的APE1/Ref-1能激活磷酸肌醇的磷酸酶第10号染色体同源缺失磷酸酶张力蛋白基因(PTEN)，PTEN负性调节磷酸肌醇3-激酶/Akt信号途径，从而影响细胞生长和生存，而这种 APE1/Ref-1依赖的 PTEN表达由 Egr-1介导[23]。Busso等[24]发现，APE1/Ref-1的泛素受体Lys残基在N-末端附近，胞内p53抑制剂MDM2能明显增强这种泛素化作用，甚至DNA损伤试剂和MDM2/p53相互作用的抑制剂nutlin-3在 p53存在下均能增加APE1的泛素化，因此，单一的泛素化不仅是降解的必要条件，而且还能改变细胞内APE1/Ref-1活性。

在不依赖CRM1的方式中，S-亚硝基谷胱甘肽能有效激活APE1/Ref-1的出核转运，这种转运是由cys93和cys310的S-亚硝基化调节。转运过程具有特异性和可逆性，可被还原剂逆转，但 H2O2不能模拟此过程，并且 p50和 HDAC2为APE1/Ref-1的出核转运抑制蛋白[25]。

2.1.3 XRCC1 人类X射线交叉互补修复基因1(X-ray repair cross complementing gene1，XRCC1)定位于人类染色体19q13.2-19q13.3，含17个外显子共 33 kb，纯化的 XRCC1蛋白由633个氨基酸残基组成。XRCC1作为支架蛋白通过直接与聚合酶β、DNA连接酶Ⅲ和多聚ADP核糖聚合酶[poly(ADP ribose)polymerase，PARP]形成复合物，共同参与因电离辐射和氧化损伤引起的碱基切除修复和单链断裂修复。有研究表明，XRCC1的表达依赖于 DNA-PKcs表达水平和PI3K/Akt信号肽的碱基活性状态，并且，放射诱导 XRCC1表达的潜能取决于其碱基表达水平。Wang等[26]发现JWA作为一种修复蛋白与XRCC1相互作用，通过MAPK信号途径调节核因子E2F，进而调节XRCC1转录，氧化损伤后，XRCC1能发挥转运蛋白作用将JWA转运至细胞核内，共同定位于病灶，并且，JWA可以保护XRCC1不受蛋白酶的降解和泛素化。在染色质中XRCC1磷酸化和在核基质中DNA损伤诱导的寡聚反应对病灶的形成至关重要，且碱基切除修复/单链切除修复的反应中心可能出现在核基质中。

XRCC1是一重要的DNA损伤修复基因，在电离辐射过程中发挥重要作用，目前国内外研究大多集中在XRCC1单核苷酸多态性与肿瘤易感性方面，而XRCC1基因多态性与电离辐射损伤关系的研究甚少，也有研究表明XRCC1的C26304T位点多态性与电离辐射损伤的发生有关[27]。

2.2 DNA双链断裂修复(DDSBR) 由于复制错误或外源性因素(如电离辐射等)导致DNA链断裂。现今认为DNA分子双链断裂的修复包括2种机制:(1)非同源性末端连接(NHEJ)，即由DNA依赖的蛋白激酶介导，通过DNA连接酶的直接作用将断裂的DNA双链重新连接起来。非同源性重组在染色质易位中修复病理性的DNA双链损伤，并且修复在VJ重组和CS R重组中产生的生理性的DNA双链损伤。因此，若缺乏正常非同源重组修复途径不仅对电离辐射敏感，还将出现严重的免疫缺陷。(2)通过同源重组的机制(HR)，其是细胞修复DNA双链断裂的主要机制。同源重组可修复由于电离辐射或DNA复制过程中复制叉受损所致的DNA双链断裂，是维持基因组稳定性及产生遗传多样性的一个重要的进化性保守机制。

3 结 语

急性肺损伤导致正常细胞死亡，并被纤维细胞替代，发生的机制目前尚未完全阐明。研究表明，当损伤性因素作用于肺组织时，对肺泡上皮和肺血管造成损伤，影响肺功能，此时局部微环境释放的一些细胞因子刺激肺组织内的干细胞增殖、分化、再生并修复损伤细胞;损伤引起的组织细胞变化又可动员骨髓中的干细胞迁移到肺组织，进一步促进损伤修复;同时肺组织损伤的内环境也能够促进外源间充质干细胞向损伤部位趋化，参与组织损伤修复。DNA损伤修复基因与放射性肺损伤的研究目前尚处于起步阶段，相关的研究报道较少，明确上述防治肺损伤的机制，包括控制肿瘤、提高生存率以及生活质量等，是今后需要加强关注的热点问题。

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