木霉的分离和对辣椒白绢病致病菌的抑制效果研究

冯俊清，李媛媛，杨扬，洪亚辉

(湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128)

辣椒白绢病是一种严重的土传性病害，由病原菌Sclerotium rolfsii Sacc.引起[1－2]。辣椒植株受害初期茎基部呈暗褐色，其上长出白色绢丝状菌丝体，呈辐射状向四周扩展，后期病部菌丝和地表菌丝体都可产生褐色白菜籽状菌核，不久后植株萎蔫落叶死亡[3]。这种病害防治难度大，固而有“南方疫病”之称。目前关于辣椒白绢病生物防治的研究较少。因此，寻找生防菌资源,探索控制辣椒白绢病的生物防治途径，对农业可持续发展具有重大意义[4－6]。木霉菌广泛存在于土壤中，对多种植物病原真菌具有拮抗作用，是一类研究得较多的生防资源，能通过竞争作用、重寄生作用、抗生作用、诱导抗性等多方面机制影响土传病原菌的正常生长和代谢[7]。

本实验拟从染病植株中分离辣椒白绢病致病菌、从病害严重区土壤中分离木霉菌，并研究木霉对辣椒白绢病的生物防治效果和机制。

1 材料与方法

1.1 材料

染病辣椒植株采集自醴陵市贺家桥镇辣椒白绢病重病区田中，土样亦从此处采集。

培养基为马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基,马铃薯汁200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉18 g。

1.2 方法

1.2.1 白绢病致病菌的分离、纯化将染病的辣椒植株去掉叶片和部分枝条后置于潮湿阴暗处，用湿毛巾盖在植株根部。24 h后根部长出白色丝状真菌。在超净工作台上用已消毒的镊子夹取少许菌丝，将真菌丝在链霉素溶液中消毒后接种于PDA培养基中，倒置在28℃的培养箱中培养。白色菌丝长满约1/2培养皿时，用接种环挑取菌丝，接种到另一个PDA培养基中。重复筛选4次，所得纯化的真菌即白绢病致病菌，做好标记，并保存。

1.2.2 白绢病致病菌菌核的培养将纯化的白绢病致病菌接种于PDA培养基平板中，倒置在28℃的培养箱中培养15 d后即得深褐色菌核。

1.2.3 木霉菌的分离、纯化将采集到的土样粉碎，分装于50 mL的烧杯中，每烧杯装20 g样土，洒水少许，使其湿润。将白绢病菌菌核用镊子夹到小烧杯样土中，每烧杯15粒。烧杯用黑色塑料膜封口，置于阴暗处。20 d后将菌核从土壤中挑出,接种到PDA培养基上，于28℃的培养箱中进行培养。约3 d后在菌核周围有木霉长出。木霉长到1/2个培养皿大小时，用接种环挑取菌丝接种到PDA培养基上。重复纯化4～5次，将纯化的木霉标记并保存。

1.2.4 对峙实验在超净工作台上将白绢病致病菌用灭菌后的接种环接种到PDA培养基平板的一侧，同时用将木霉接种到PDA培养基的另一侧,于28℃的恒温培养箱中倒置培养，并观察记录抑制效果，用十字交叉法测量病原菌菌落半径，以只接种致病菌的平板作对照。于平板培养第7天分别计算13株木酶对辣椒白绢病致病菌的抑菌率，计算方法见公式（1）。

抑菌率（%）＝[（对照菌落半径-与木霉对峙培养的菌落半径）/对照菌落半径]×100[8]（1）1.2.5外界环境条件对木霉生长的影响由对峙实验结果比较分析，选出一株对辣椒白绢病致病菌有较强抑制效果的木酶菌，研究外界环境条件（温度、培养基pH值、外界光照时间）对其生长状况的影响。（1）温度对木霉生长影响。将4个恒温箱的温度分别设定为30、40、50、60℃，再将已接种的PDA平板上置于其中，进行倒置培养，观测木霉生长状况。（2）环境pH值对木霉生长影响。配制不同pH值的PDA培养基，于木霉接种后置于28℃的恒温培养箱中进行倒置培养，观测其生长状况。（3）光照强度木霉生长状况影响。将待试木霉菌种放置于室外接受阳光直射，光照处理3、6、9 h后，分别接种于平板上进行倒置培养，观测其生长状况。

2 结果与分析

2.1 白绢病致病菌的分离

如图1所示，在PDA平板培养基上成功得到纯化的辣椒白绢病致病菌。病菌菌丝发达，白色，有绢丝状光泽，在基物上呈羽毛放射状向四周生长；菌丝有隔，生长速度快；菌丝细长，适应能偏酸性环境。

2.2 白绢病致病菌菌核培养

如图2所示，致病菌在PDA培养基上培养10 d后，菌丝上开始凝结，形成很多细小颗粒状菌核，初为白色或淡黄色，后变为褐色至黑褐色，呈球形或不规则形，直径为0.5～3.0 mm。表面平滑有光泽，结构致密，干燥时外壳极坚硬。

图1 在28℃恒温箱中培养5天后的白绢病致病菌

图2 在28℃恒温箱中培养15天后的白绢病致病菌菌核

2.3 木霉的分离、纯化

从采集到的土样中共分离得到13株木霉菌。木霉生长速度快，培养初期菌丝白色、半透明，培养5～6 d开始形成孢子，孢子呈淡绿色、淡黄色或绿色。

2.4 对峙实验

由表1可以看出，分离出的木霉菌在实验条件下对辣椒白绢病的生长均有不同程度的抑制作用，其中7号和13号木霉的抑制效果最好，抑菌率分别达到73.2%和74.1%。

表1 1-13号木霉与致病菌对峙实验抑菌圈半径

2.5 外界环境条件对木霉生长的影响

2.5.1 温度对木霉生长影响在不同温度下培养72h，每天定时测量菌落直径，所得木霉生长数据见表2。表2数据表明，木霉在30～40℃之间生长速度较快，生长状况较好；在50℃左右虽然生长速度较慢，但仍然有菌丝体生长；60℃以上则无生长。这说明木霉菌具有一定的耐热性，但是温度过高会杀死菌种，使之不能生长。

2.5.2 环境pH值对木霉生长影响如表3所示，木霉在环境条件pH值5.0、6.0、7.0时生长状况良好，其中6.0时生长速度最快，在pH值变为8.0时，生长速度缓慢。由此可见木霉的最适pH为弱酸性，在弱酸性环境中会迅速生长，碱性环境会抑制木霉的生长。

表2 不同温度下条件下木霉生长状况

表3 不同pH值对木霉生长的影响

2.5.3 光照时间对木霉生长的影响如表4所示，光照对木霉有一定的影响，光照3 h与光照6 h对木霉的影响基本无差异，但当光照时间达到9 h后，木霉的生长受到了抑制。

表4 不同光照时间对木霉生长的影响

3 小结与讨论

本实验共分离纯化得到13株木霉菌，从对峙实验结果可以看出，分离到的木霉对白绢病致病菌均有不同程度的生长抑制作用，为进一步研究木霉对白绢病的抑制机理打下基础。

实验结果表明，木霉是一种较能耐热、耐酸性菌，当环境温度达到50℃时也能生长。在中性或偏酸性环境下，木霉生长速度极快，在偏碱性的条件下生长则会受到抑制。光照强度也是影响木霉生长的一个重要因素，实验证明，强日光照射6 h不会对木霉生长产生影响，光照9 h以上时会对木霉起抑制作用。这些实验数据能够充分证明木霉是一种优良的拮抗微生物，在生物防治领域具有重要的研究价值[10-11]。它能够在环境比较恶劣的情况下生长，能产生多种酶系抑制病原微生物的生长。木霉生长迅速，利于同病原菌竞争生存空间和营养物质，也可以达到抑菌的作用。

本实验只是初步探讨了外界环境对木霉生长状况的影响和木霉对辣椒白绢病致病菌的抑制效果，今后需要更深入地研究其作用机制和生物学特性，以期寻找到更多、更高效、更适合于工业化生产的菌株，为木霉生产提供更可靠的科学依据。

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