一氧化氮对小鼠胚胎附植影响的研究

廖海艳，王方剑，薛立群

（1.湖南第一师范学院，湖南 长沙 410205；2.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410205）

胚胎附植是指胚泡与子宫内膜粘附并植入子宫内膜基质、形成胎盘的过程，成功的植入不仅取决于胚泡滋养层细胞对母体子宫的侵入性，而且取决于子宫对胚泡的相容性和营养供应。前者涉及细胞的黏附、迁移、ECM的降解等，后者涉及蛋白酶对子宫内膜的组织降解、更新以及血管新生。而NO（一氧化氮）是调节血管功能和炎症反应,介导组织重建和细胞凋亡,影响胚胎发育和附植多种生理过程的一个重要的旁分泌调节因子[1]。生理状况下，NO、ECM、MMPs、TIMPs（基质金属蛋白酶抑制剂）、细胞因子、生长因子、细胞等诸多因素之间，存在着复杂的网络调节控制机制，以适应机体组织正常的胚胎发生和附植、器官形成、组织塑型、创伤修复和动态平衡的需要[2－3]。本试验是用子宫角注射的方法，在小鼠胚胎附植期子宫角注射NOS的非特异性抑制剂N-硝基L-精氨酸甲酯（L-NAME）或L-NAME+SNP（硝普钠）来研究一氧化氮（NO）在胚胎植入过程中可能发挥的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料实验动物为BABL系小白鼠，购自湖南中医学院小动物实验室，50日龄,体重20 g左右。实验鼠在自然光照条件下采用自由采食和饮水的方式饲养。

1.1.2 试剂L-NAME和SNP均由美国Sigma公司提供。L-NAME和SNP的配制:分别称取适量的L-NAME和SNP，溶于无菌的9 g/L氯化钠溶液中。

1.2 方法

1.2.1 子宫角注射将雌性、雄性小鼠按2∶l比例合笼，次晨查出阴栓者定为妊娠第l天（D1）。雌鼠于D3下午麻醉后，左侧子宫角内注药，右侧子宫角内注入等体积（4 pL）生理盐水作为对照。

1.2.2 试验设计实验分为3组，每组处理小鼠8～l0只。处理1:于附植早期/中期/后期分别处理8～10只；于D2/D4/D6下午麻醉后，注射L-NAME 0.2 mg/只。受试动物分别于注药后2 d（D4/D6/D8）剖检，观察并计数两侧子宫角植入胚胎数,并收集双侧子宫,直接存放于－80℃以制作组织切片。处理2:6～8只雌鼠，D2下午麻醉后，注射L-NAME 0.2 mg+SNP 10μg/只，注药后6 d（D8）剖检，观察并计数两侧子宫角植入胚胎数,并收集双侧子宫,直接存放于－80℃以制作组织切片。处理3（胚胎发育观察组）:6～8只雌鼠，D2下午麻醉后，注射LNAME 0.2 mg/只。注药后6 d（D8）剖检，观察并计数两侧子宫角植入胚胎数,并收集双侧子宫,直接存放于－80℃以制作组织切片。

1.2.3 子宫组织切片和形态学观察子宫组织切片的制作是用经10%中性福尔马林液固定好的子宫组织样品进行修整，使之符合石蜡组织切片要求，然后进行脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋；进行连续切片，分段取样铺片，切片厚度为5μm，对铺好的玻片放入烘箱，58℃过夜烤片；进行HE（haematoxylin eosin）染色:对烤好的切片进行脱蜡、脱二甲苯、苏木素染色、盐酸酒精分化、兰化、伊红复染和封片，42℃烘片12 h，用组织切片盒保存备用。在生物显微镜或倒置显微镜下对切片进行观察，对特征性图像进行显微照相。

2 结果与分析

2.1 NO对小鼠胚胎植入数的影响结果

如图1至图4所示，小鼠子宫角注射NOS抑制剂L-NAME后,胚胎植入数出现下降，当L-NAME和SNP合并注射时则使胚胎植入数恢复到正常水平，这说明NO参与了胚胎植入过程的调节。

图1显示L-NAME 0.2 mg/只处理后,在胚胎附植前期（D4）、附植期（D6）、附植后期（D8）的两侧子宫角胚胎植入数的变化。由图可知,子宫角注射LNAME后,子宫角的胚胎植入数受到显著抑制。

图1 子宫角注射NOS抑制剂对小鼠胚胎植入的影响

图2显示妊娠小鼠于D8子宫角注射LNAME或L-NAME和SNP合并注射对小鼠胚胎植入的影响。从此图中可以看出,与对照侧相比,L-NAME 0.2 mg/只处理组小鼠子宫角的胚胎植入数显著降低,当L-NAME和SNP（一种NO的自发性供体）合并注射时,对小鼠的胚胎植入数没有多大影响。

图2 D8注入NO抑制剂和D8注入NO抑制剂+SNP对小鼠胚胎植入的影响

图3显示经左侧子宫角注射L-NAME，右侧子宫角注射生理盐水处理后于D8时子宫的发育情况。通过图片可以看出，与对照侧相比,L-NAME处理侧小鼠子宫角的胚胎植入数为0个，而对照侧为4个胚胎数。由此可见，L-NAME处理侧小鼠子宫角的胚胎植入数显著降低。

图4显示经左侧子宫角进行L-NAME和SNP合并注射，而右侧子宫角注射生理盐水处理后在D8时子宫的发育情况。通过图片可以看出，与对照侧相比,L-NAME和SNP合并注射处理侧小鼠子宫角的胚胎植入数为3个，而对照侧为4个胚胎数。由此可见，当L-NAME和SNP合并注射时,对小鼠的胚胎植入数没有多大影响。

图3 左侧子宫角注射LNAME后于D8时子宫发育情况

图4 左侧子宫角进行LNAME和SNP合并注射后于D8时子宫发育情况图

2.2 子宫内膜组织形态学观察结果

为了更进一步了解NO对小鼠胚胎植入的影响，对所收集的子宫均进行了组织切片和组织形态学观察。通过组织形态学观察可以发现:在小鼠胚胎附植过程中，NO对子宫内膜的发育有影响。影响表现为对血管的通透性、厚度的变化的影响以及对蜕膜细胞的形成有作用。而子宫内膜的这些结构在胚胎附植的不同时期所表现出的变化特征均有所不同。

在附植前期，通过形态学观察显示，妊娠对照侧和抑制侧的子宫内膜均有一定程度发育,即柱状上皮细胞开始增高、变大，腺体数目也都开始增多。但妊娠对照侧子宫内膜的发育比较明显，尤其是柱状上皮细胞增高比较明显（见图5）。

图5 附植前期子宫切片图（100×；左图为对照侧子宫，右图为抑制侧子宫）

在附植期，通过在400×显微镜下仔细观察可发现，妊娠对照侧的子宫内膜进一步发育，单层柱状上皮细胞增高更加明显，腺体数目明显增多,羽状突起非常明显；抑制侧子宫内膜柱状上皮细胞相对高度较低，腺体数少，羽状突起较少。对照侧螺旋动脉丰富且扩张，通透性增强，基质细胞形成蜕膜细胞，发生明显的蜕膜样变，基质变得疏松，同时子宫内膜腺呈现出明显的活动状态;而抑制侧子宫内膜基质则相对致密，螺旋动脉的分布也不是很明显（见图6）。

图6 附植期子宫切片图（400×；左图为对照侧、右图为抑制侧）

3 讨论

本研究采用子宫角注射法研究了NO对小鼠胚胎植入的影响，以探讨NO在胚胎植入中的作用机理。子宫角注射法所使用的药物剂量小，可以显示出药物对胚胎植入的直接影响和局部作用[4]。通过子宫角注射L-NAME后，子宫中NO的产生确实受到了抑制。SNP是一种NO释放剂，它可自发释放NO，当在L-NAME中加入SNP后再对小鼠进行子宫角注射，结果发现，处理侧的胚胎植入数没有明显的变化。以上实验结果表明，NO在小鼠胚胎植入过程中起重要作用。这个作用具体通过什么来实现，还有待于进一步研究。沈政等[5]采用小鼠胚泡体外植入模型，利用NOS抑制剂L-单甲基-精氨酸、NO供体s-亚硝基-乙酰青霉胺8-BrcGMP对胚泡黏附扩展以及MMP-2分泌的影响进行了研究，发现NO能促进体外小鼠胚泡的黏附、扩展及MMP-2的分泌，提示NO的这些作用可能是通过cGMP来实现的。

子宫血管通透性的增强是着床的一个标志，子宫充足的血液供给对于胚胎着床是十分必要的。在血管中，NO由eNOS催化合成，是有效的血管扩张和血小板抑制因子。eNOS在分泌期子宫内膜腺上皮和微血管内皮中表达[6]。iNOS在人月经周期的分泌晚期和月经开始时的子宫内膜上皮细胞、免疫活性细胞和蜕膜基质细胞中表达，高浓度时可合成NO，并且具有前炎症反应的特点，是支持和维持蜕膜过程必需的因子。eNOS和iNOS在着床期发生上调[7]。另外，eNOS在着床位点锚定的绒毛细胞和滋养层细胞中的表达显著升高，在合体滋养层也有表达，说明eNOS对着床和血管侵入过程也起一定的作用。本试验通过抑制附植期NO的形成，使得子宫平滑肌明显紧缩、子宫血管的通透性也显著降低，提示NO可能通过对血管的通透性的调节来影响子宫内膜的脱膜化过程。

胚胎植入受一系列复杂因素的严格调控，胚胎成功植入需要各种因子之间的协调作用。胚胎植入过程中一个最突出的现象是子宫内膜ECM成分的重组和更新。研究表明，MMPs是胚胎植入过程中降解ECM的主要酶，其蛋白表达与胚胎滋养层细胞的最大侵入能力相吻合，是构成胚胎侵入能力的主要因素[8]。丁隽等[9]应用基质金属蛋白酶抑制剂（l，l0一菲罗啉）作用于妊娠大鼠造成流产的模型，以验证基质金属蛋白酶在正常妊娠中的作用时发现，基质金属蛋白酶抑制剂在妊娠期抑制MMPs的表达，使MMPs的分泌不足，导致流产或胎鼠宫内生长迟缓，说明了MMPs在胎盘滋养细胞浸润和妊娠的维持中具有重要作用。目前，对于NO调节子宫MMP-9基因转录水平的分子机制尚不清楚，这还有待于进一步研究。

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