氯霉素免疫抗原及包被抗原的制备

罗舜菁，钟寒燕，刘成梅，陈婷婷，陈发荣，严杰琳

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

氯霉素免疫抗原及包被抗原的制备

罗舜菁，钟寒燕，刘成梅，陈婷婷，陈发荣，严杰琳

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

采用混合酸酐法合成30:1～10:1 三个不同起始物质的量比的氯霉素免疫抗原(HAP-KLH)，采用活泼酯法(EDC-NHS)合成40:1～1:1 七个不同起始物质的量比的包被抗原(HAP-OVA)，紫外测定HAP-KLH偶联比25:1～8:1，HAP-OVA偶联比23:1～1:3。间接竞争ELISA实验优化包被抗原，在23:1～3:1偶联比范围内，氯霉素(CAP) IC50值为36～15ng/mL，随着偶联比的减小而降低，当偶联比低于3:1则略为上升。确定了包被抗原HAP-OVA最佳偶联比为3:1。本研究表明包被抗原的偶联比对ELISA测定IC50值有重要影响，应合成不同偶联比的包被抗原，选出最佳偶联比。

氯霉素；免疫抗原；包被抗原；偶联比

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一种广谱抗生素，对革兰氏阳性、阴性菌均有抑制作用[1]。氯霉素对人体有较强的副作用和毒性，可导致再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症[2]。2002年中国农业部《动物性食品兽药残留规定》中规定氯霉素在可食部分不得检出，在出口的日常检测中列为必检项目。但由于其低廉的价格和稳定的抗菌性，在畜牧业及水产养殖业中违法使用的现象仍屡见不鲜[3]。

对氯霉素的检测方法有微生物检测法、色谱分析法、免疫检测法[4]。微生物法灵敏度低；色谱分析法样品前处理麻烦，费用高；免疫分析法具有快速、灵敏度高、高通量的特点。其中免疫分析方法有传统的酶联免疫分析、胶体金免疫层析技术、化学发光免疫分析法及新的液态芯片技术[5](又称悬浮阵列技术)，这些检测方法都是以抗原抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析方法。它们的检测灵敏度都与单克隆抗体的特异性、亲和力密切相关[6]，若欲制备高特异性、高亲和力的单克隆抗体不仅需要优质的免疫抗原，而且筛选产单克隆抗体细胞株时所用包被抗原偶联比直接影响单克隆抗体质量的判断。氯霉素是小分子物质，属于

半抗原，需要与大分子物质偶联合成人工抗原才具有免疫原性，人工抗原包括免疫抗原和包被抗原。CAP与琥珀酸酐反应的产物是琥珀氯霉素(HAP)，它和CAP有相同的抗原决定簇，可利用HAP制备抗CAP单克隆抗体。本实验室已经合成牛血清白蛋白(BSA)为载体的HAP-BSA免疫抗原，并制备出抗氯霉素单克隆抗体(mAb)，但亲和性未达到商品化要求(CAP的IC50值为2～5ng/mL)，已制备出的单克隆抗体则用来考察包被抗原偶联比对酶联免疫吸附实验(ELISA)的影响。为了得到更高亲和力的mAb，重新合成新抗原免疫小鼠，文献报道[7]钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)对比于常用的牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)等具有更好的免疫原性，但由于价格昂贵，较少用来作为载体蛋白，且未见报道用于合成氯霉素免疫抗原。本研究采用混合酸酐法将HAP与KLH偶联合成免疫抗原(HAP-KLH)，采用活泼酯(EDC-NHS)法将HAP与OVA偶联合成检测用包被抗原。按3个不同起始物质的量比合成不同偶联比的HAP-KLH免疫抗原，分别免疫。按7个不同起始物质的量比合成7个不同偶联比的HAP-OVA包被抗原。抗体为同一抗体，包被抗原采用上述7个不同偶联比的HAP-OVA，利用间接竞争酶联免疫吸附实验(ic-ELISA)分别测定对应的IC50值，IC50值最低时对应的包被抗原的偶联比为最佳偶联比，为抗CAP单克隆抗体的制备和灵敏度高的检测方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯霉素(CAP)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl) BBI公司；琥珀氯霉素(HAP)、钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) Sigma公司；酶标板 美国Corning公司；其余试剂均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

TU-1900双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；Multiskan MK3酶标仪 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 人工抗原的合成

1.3.1.1 混合酸酐法合成HAP-KLH

称取一定量的HAP，溶于DMF和1,4-二氧六环混合液(按体积比1:1配制)中，通过稀释使最终质量浓度为12.01、8.58、5.15μg/mL，体积各1mL，分别编号①、②、③。分别加入三正丁胺10μL，冰浴条件下搅拌反应10min，加入氯甲酸异丁酯7μL，室温下搅拌反应1h，此为A液；称取7.3mg K LH蛋白，溶于3mL的 0.01mol/L PBS溶液中，调节pH8.5，平均分成3份，编号①、②、③，此为B液。冰浴搅拌下，将A分别逐滴加入到编号相同的B中，维持pH8.5，冰浴条件下搅拌反应4h，反应液装入透析袋中，用pH7.4 PBS透析3 d，每天换液3次。透析后冷冻干燥备用。

1.3.1.2 EDC-NHS法合成HAP-OVA

称取7.0mg HAP溶于0.01mol/L PBS溶液中，分别加入一定量的EDC-HCl和NHS，控制pH值在5.0左右，室温避光振荡活化15min。加入20mmol/L的β-巯基乙醇4μL淬灭未反应的EDC-HCl。将其平均分成7组，对应编号为①、②、③、④、⑤、⑥、⑦，按H A P与OVA的起始物质的量比为40:1、30:1、20:1、10:1、7:1、4:1、1:1分别加入一定量OVA溶液，室温反应2h后，反应液中加入10mmol/L盐酸羟胺3μL淬灭未反应的NHS。反应液用pH7.4的0.01mol/L PBS透析3d，透析后冷冻干燥备用。

1.3.2 人工抗原的的鉴定

紫外扫描HAP-KLH、标准品KLH、OVA、HAP。

1.3.3 人工抗原偶联比的测定

1.3.4 HAP-OVA的优化

1.3.4.1 间接ELISA法确定HAP-OVA、抗体最佳工作浓度

包被：将7个偶联比的包被抗原HAP-OVA分别倍比稀释成一系列质量浓度梯度10、5、2.5、1.25、

0.625、0.3125、0.1562μg/mL，加至酶标板，同列为同一浓度，100μL/孔，4℃冰箱过夜。用PBST洗液洗5遍，吸水纸上拍干。封闭：每孔加380μL封闭液37℃封阻70min。洗涤同上。加抗体：抗体稀释倍数从2×104到1.28×106作倍比稀释。加入酶标板中，同行七孔同浓度，37℃温育1h，洗涤同上。加二抗：每孔加100μL HRP-羊抗兔IgG，37℃温育1h，洗涤同上。显色：每孔加100μL TMB显色液，37℃温育15min。终止：每孔加入50μL终止液，用酶标仪读取各孔OD450值。

以OD450值为1.0左右孔对应的HAP-OVA包被浓度为抗原最佳工作浓度，此孔对应的抗体浓度作为抗体最佳工作浓度。

1.3.4.2 ic-ELISA法测定CAP的IC50值

将7个偶联比的HAP-OVA分别按1.3.4.1节确定的最佳浓度包板，进行ic-ELISA实验，另配制一系列质量浓度的CAP标准溶液(103、102、50、20、10、5、0ng/mL)，加入50μL CAP标液和50μL最佳工作浓度的单抗，测定不同浓度CAP的抑制率，以抑制率B/B0(B是CAP不同标准浓度对应的OD450值，B0是CAP浓度为0时OD450值)为纵坐标，以不同浓度的CAP为横坐标绘制曲线，抑制率为50%对应的CAP浓度为半数抑制浓度IC50值。整个ELISA实验做3个平行，取平均值。

2 结果与分析

2.1 人工抗原的鉴定结果

KLH、HAP、偶联物HAP-KLH、标准品OVA、偶联物HAP-OVA的紫外扫描见图1。为与偶联物透析环境相似，将KLH标准品溶于PBS溶液，在4℃放置3d后进行紫外扫描，结果见图1a。KLH在200～400nm波长范围内没有明显的特征吸收峰，吸光度随波长的减小一直呈增大趋势。由图1b可知，HAP特征吸收峰为276nm。由图1c可知，HAP-KLH的吸收在276nm附近明显有拐点，260～278nm处吸收度大致持平，对比图1a可知，这一变化主要是偶联物中HAP的影响，可以证明HAP-KLH偶联成功。OVA、HAP、HAP-OVA的特征吸收峰分别在278、276、277nm，由此可判断出HAP-OVA偶联成功。

图1 紫外扫描图Fig.1 UV absorption spectra of KLH chloramphenicolsuccinate, a chloramphenicolsuccinate-KLH conjugate, OVA and a chloramphenicolsuccinate-OVA conjugate

2.2 免疫抗原偶联比结果

免疫抗原HAP-KLH偶联比结果见表1。相关研究[9]表明，免疫抗原的偶联比太高会导致特异性不好，偶联比太低则抗体产生的滴度不高，且根据本实验室前期研究结果，偶联比在10:1～20:1为宜，过多的半抗原可能会影响载体蛋白与淋巴细胞表面的接触致使免疫反应减弱。不同人工抗原具有不同的最佳偶联比，为了获得最佳免疫效果，得到特异性最好和效价最高的单克隆抗体，应制备不同偶联比的免疫抗原免疫小鼠，并用不同的剂量免疫小鼠，低剂量较难刺激机体免疫，但一旦免疫成功则能得到更高亲和力抗体。

表2 HAP-OVA偶联比Table 2 Coupling ratios corresponding to initial molar ratios between chloramphenicolsuccinate and OVA

包被抗原偶联比结果见表2。用不同的方法合成免疫抗原和包被抗原，可以避免合成免疫抗原时引入氯甲酸异丁酯部分基团所造成的桥抗体的干扰[10]。采用活泼酯法合成了偶联比23:1～1:3的包被抗原。

2.3 包被抗原优化结果

表3 ic-ELISA实验结果Table 3 Results of determination of IC50 of CAP by the ic-ELISA method

在ic-ELISA实验中，用不同偶联比的HAP-OVA包板测得CAP的IC50值结果见表3。不同偶联比的HAPOVA作为包被抗原进行间接竞争ELISA实验时，对应得到CAP的IC50值不一样。CAP的IC50值越低，表明CAP对单抗与包被抗原结合的抑制作用越强，即抗体对待测小分子CAP的灵敏度越高。结果显示，在26:1～3:1偶联比范围内，CAP的IC50值为36～15ng/mL，随着偶联比的减小而降低，当偶联比为3:1～1:3，IC50值从15ng/mL略为上升至18ng/mL。一方面是因为包被抗原偶联比过高，偶联在大分子OVA上的半抗原HAP相互拥挤，HAP的舒展性受到抑制，阻碍了HAP与抗体的结合，使使IC50值偏低；另一方面，半抗原HAP相互叠加所形成网络结构，使加入的竞争品CAP嵌入其中，影响CAP抗原表位的充分展露，导致实际和抗体结合的CAP量减少，要达到半数抑制所要加入的CAP量增大，这两方面的作用，导致在一定范围内随着包被抗原偶联比增加IC50值则增大。当偶联比为1:1～1:3时，包被抗原的质量浓度增大至1.25μg/mL，包被在酶标板上的蛋白质分子OVA形成网络结构使待测小分子CAP嵌入其中，影响CAP与抗体的结合，IC50值略微上升。

3 结 论

采用混合酸酐法以KLH作为载体蛋白合成氯霉素免疫抗原，通过紫外光谱检测证明偶联成功。采用活泼酯法合成以OVA为载体的包被抗原，考察不同偶联比对间接竞争ELISA实验的影响。结果表明，对于同一抗体，不同偶联比的包被抗原测得的IC50值不同。在单克隆抗体整个制备过程中，抗体亲和力是否达到要求，ic-ELISA测定的IC50值为最主要的反应指标。IC50值越低，表明抗体亲和力越好，抗体与待测小分子反应越灵敏。如果包被抗原未优化，测得的IC50值可能偏高，导致误判所制备出的单克隆抗体不合格，所以优化包被抗原，选出最适偶联比的包被抗原对真实测定IC50值至关重要。在制备免疫抗原和包被抗原时，常常对免疫抗原进行偶联比的考虑，而忽略了制备一系列不同偶联比的包被抗原，本研究表明了包被抗原的偶联比对ELISA实验影响的重要性。

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Preparation of Chloramphenicol Immunogen and Coating Antigen

LUO Shun-jing，ZHONG Han-yan，LIU Cheng-mei，CHEN Ting-ting，CHEN Fa-rong，YAN Jie-lin
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Chloramphenicolsuccinate and keyhole limpet hemocyanin (KLH) were mixed at 3 initial molar ratios, namely 30:1, 20:1 and 10:1, to synthesize chloramphenicol (CAP) immunogens (hapten-KLH conjugates) with coupling ratios of 25:1, 16:1 and 8:1, respectively. Additionally, chloramphenicolsuccinate was mixed with ovalbumin (OVA) at 7 initial molar ratios, namely 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 7:1, 4:1 and 1:1, to synthesize CAP coating antigens (hapten-OVA conjugates) with coupling ratios determined by the UV spectrometric method of 23:1, 20:1, 14:1, 6:1, 3:1, 1:1 and 1:3, respectively. Indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay (ic-ELISA) experiments were carried out to choose a CAP coating antigen with an optimal coupling ratio. CAP was determined with the CAP coating antigens to have IC50 values ranging from 15 to 36 ng/mL. As the coupling ratio between chloramphenicolsuccinate and OVA decreased from 26:1 to 3:1, there was a decrease in the IC50 value of CAP. When the coupling ratio was less than 3:1, the IC50value of CAP exhibited a slight increase. These findings demonstrate that a CAP coating antigen with an optimal coupling ratio should be synthesized for the ic-ELISA assay of IC50significantly influenced by coupling ratio.

chloramphenicol；immunogen；coating antigen；coupling ratio

R446.61

A

1002-6630(2010)10-0091-04

2009-08-05

江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ09062)

罗舜菁(1969—)，女，副教授，硕士，研究方向为食品安全。E-mail：luoshunjing@yahoo.com.cn