微量、快速测定葡萄与葡萄酒总酚

徐国前，张振文,2,*，郭安鹊,2，房玉林,2，栾丽英

(1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100)

微量、快速测定葡萄与葡萄酒总酚

徐国前1，张振文1,2,*，郭安鹊1,2，房玉林1,2，栾丽英1

(1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100)

基于Folin-Ciocalteu分光光度法的原理，借助微量移液器和微波处理，通过优化反应条件，建立一种新的微量、快速测定葡萄与葡萄酒总酚含量的方法。实验得到体系的最佳反应条件为0.1mL测试样品，0.1mL 1mol/L Folin-Ciocalteu试剂和0.8mL 60g/L Na2CO3溶液，在微波炉的中档下处理20s后测定765nm波长处的吸光度。以没食子酸为标准品作标准曲线，在质量浓度1～50mg/L范围内与吸光度呈良好线性关系(R2=0.9996)。对葡萄皮与葡萄酒进行加标回收率实验的平均回收率分别为98.1%和97.2%，精密度(n=9)测定相对标准偏差(RSD)分别为1.40%和1.01%。该方法不但量微、快速，而且操作简便，重复性好，结果精准可靠。

葡萄；葡萄酒；总酚；测定；Folin-Ciocalteu法

多酚是植物中一类重要的次生代谢物，它们除赋予植物叶片、花瓣和果实不同颜色外，在植物生理生化上，具有吸收紫外线和自由基而起到保护细胞的生理作用，也作为植物抗毒素抵抗微生物和真菌的浸染[1-2]，阻止食草动物取食等。多酚也是葡萄酒的重要成分，构成了葡萄酒特有的感官特征；因其可以消除人体内的自由基而起到抗氧化、抗肿瘤、抗癌、降血脂、预防动脉粥样硬化和冠心病等保健作用[3-5]。因此在控制葡萄酒质量时，必须检测总酚含量。

目前，定量分析葡萄与葡萄酒总酚的方法主要有氧化滴定法、色谱分析法和分光光度法3类[6]，每类中又有不同的具体方法，也有各自的优缺点。相比较而言，Folin-Ciocalteu分光光度法价格低、操作方便，且测定不同生物原料中的总酚准确，所以是定量分析总酚的普遍方法，这也是美国官方分析化学师协会(AOAC)定量分析葡萄酒或蒸馏酒精内丹宁的方法[7]。但是，Folin-Ciocalteu法受当时条件所限[8]，测定过程冗长费时，所耗试剂和标准物质量大，标准曲线制作和测试过程也非常繁杂。后来Bajaj等[9]和Ainsworth等[10]进行减少反应体积改良实验，van Alstyne[11]和田文礼等[12]则是通过升

高温度加速反应来缩短时间；但如果通过加热样品来加速反应，又易使颜色分解较快，结果相当不稳定[13]，且试剂和标准物质用量仍然相对较多，仍较耗时。随着微量移液器的广泛使用，使得精确量取微量液体成为现实；同时微波已作为辅助手段在化学和生物样品的准备等领域得到了广泛的应用[14]。

本实验基于Folin-Ciocalteu分光光度法原理，借助微量移液器和微波辐射处理，优化反应条件，建立一种新的微量、快速测定葡萄与葡萄酒总酚含量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄(户太8号) 西安市葡萄研究所；干红葡萄酒(2008) 王朝葡萄酿酒有限公司。

钨酸钠、钼酸钠和硫酸锂(均为分析纯) 国药集团上海化学试剂公司；浓磷酸、浓盐酸和无水Na2CO3(均为分析纯) 西安化学试剂厂；没食子酸(分析纯) 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

UV-1700型紫外分光光度计 日本岛津公司；KQ-300DE型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；WP700(21)型微波炉 格兰仕电器有限公司；移液器 德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 试剂的配制

Folin-Ciocalteu试剂：按文献[15]方法配制，得到2mol/L的试剂，用时稀释1倍。

Na2CO3溶液：称取200.00g无水Na2CO3，溶于950mL沸水中，冷却至室温后定容至1000mL，24h后过滤得到200g/L溶液，用时分别稀释至不同质量浓度。

50.0mg/L标准溶液：称取没食子酸5.0mg溶解于8.0mL的甲醇中，并用水定容至100mL(现用现配，冷藏时间不能超过2周)。

1.3.2 总酚的提取

称取40℃烘干的葡萄皮0.050g，用5.0mL 体积分数为80%的甲醇溶液(含0.012mol/L盐酸)在40℃，40kHz超声波提取40min后，在8500r/min 4℃离心15min，提取2次，合并提取液，定容到10.0mL，然后取1.0mL用双蒸水稀释至10.0mL测定。

葡萄酒直接吸取1.0mL于100mL容量瓶中加8.0mL甲醇后定容测定。

1.3.3 微波处理的优化实验

在聚苯乙烯离心管内加入0.1mL 30.0mg/L的标准溶液和0.1mL 1mol/L Folin-Ciocalteu试剂，混合均匀后，在1～8min内加入0.8mL不同质量浓度的Na2CO3溶液(20、30、40、50、60g/L)。然后放入盛有100mL室温水的塑料杯内，且置于微波炉中心，在微波炉的中低档和中档下分别微波辐射处理10、20、30、40s后测765nm波长处的吸光度，以确定最佳的Na2CO3质量浓度、微波辐射功率和时间；另外把放入35℃水中作对照(100.0mL水在中低档处理30s时，水温达35℃)。

1.4 数据统计分析

各数据重复4次，采用数据统计软件DPS(Data Processing System) v7.05版对试验所得结果进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 反应条件的优化

图1 不同质量浓度Na2CO3在不同辐射功率和时间的吸光度变化Fig.1 Absorbance of Na2CO3 with various concentrations at different irradiation power and time

从图1可以看出，当功率和处理时间相同时，Na2CO3溶液质量浓度高的吸光度大；当Na2CO3溶液质量浓度相同，除60g/L的Na2CO3溶液在中档辐射20s，吸光度达到最大值后开始下降外，其他在同档情况下，都是随着辐射处理时间延长，吸光度在逐渐增大；在Na2CO3溶液质量浓度和处理时间相同时，中档处理的吸光度均比中低档的大。统计结果分析表明：50g/L和60g/L Na2CO3溶液的处理中，除对照和中低档辐射10s处理和其他的差异极显著外，同质量浓度之间差异不显著(P＜0.01)；20、30、40g/L Na2CO3溶液处理之间变化则较大。这和Akins等[14]测试蛋白质时得到的结果相似。因此，下面采用60g/L的Na2CO3溶液中档辐射20s作为反应条件。

Folin-Ciocalteu法测定总酚的原理是：Folin-Ciocalteu试剂在弱碱性条件下被酚还原产生复杂的蓝色混合物，该蓝色物质在765nm处有最大吸收峰[8]。且吸光度与总酚的含量在一定浓度范围内呈线性关系。但该反应的Folin-Ciocalteu试剂和形成的蓝色产物在碱性或高温下都易分解，而酚又要求在碱性条件下才能反应。所以升高温度虽可以加速反应，达到最大吸光度的时间也变短，但表现不稳定；碱性过强也促进分解。所以在

常规Folin-Ciocalteu法测总酚时温度不宜超过30℃，Na2CO3的质量浓度一般不超过50g/L[16-18]。在微波辐射处理下，因反应极快，时间特短，Folin-Ciocalteu试剂和蓝色素虽在高碱性条件下，但分解较少。

微波加速反应是种非热效应，与微波的高频电磁波特征相关。微波炉辐射也可以提高水温，但这种急剧的加速变化与温度变化是独立的，同时观察到在同样温度下对照处理和微波炉辐射处理之间差异极显著。所以微波炉加热这种基本方式不是反应加速的主要原因。因此推测，当微波通过测试液时，加速了测试液内分子间的碰撞和摩擦，促进试剂的化学扩散，并增强了结合，这样微波辐射极大加速了测定总酚时反应速度。另外，系统中水分子在连续高速变化的电磁场下高速旋转，分子间作用力可能发生一些特殊变化，例如溶剂自身分子之间、溶质与溶剂分子之间、酚分子之间不能形成氢键，这样离子化分子增多，便于快速反应。

2.2 方法评价

2.2.1 标准曲线的制作和精密度测定

准确吸取50.0mg/L的没食子酸标准溶液0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.10mL分别于6支(1～6号)5mL离心管中，然后以体积分数为8%的甲醇溶液补到0.1mL；如测试样品时，取0.1mL样品。加入0.1mL Folin-Ciocalteu试剂后充分振荡，在1～8min内分别加入0.8mL 60g/L Na2CO3溶液，摇匀放入内有100mL室温水的塑料杯内，且置于微波炉中心，在中档下处理20s。1号试管溶液为空白调零，测765nm波长处的吸光度，以吸光度对质量浓度进行回归，得标准曲线回归方程Y=0.0108X－0.0021(R2= 0.9996)，线性范围1～50mg/L。

对稀释后的葡萄皮提取液和葡萄酒样各进行9次平行测定，结果葡萄皮和葡萄酒总酚含量分别为18.53mg/g和2500mg/L，相对标准偏差(RSD)分别为1.40%和1.01%，说明该方法具有较好的精密度。

2.2.2 加标回收率实验

表1 加标回收率实验Table 1 Recovery experiments for spiked samples

依据2.2.1节的结果，准确吸取稀释后葡萄皮提取液和葡萄酒样，分别按其总酚含量的80%、100%和120%添加没食子酸标准溶液(n=3)，测定各样品的总酚含量，并计算回收率。加样的结果见表1。

由表1可见，此方法测定葡萄皮和葡萄酒总酚的加样回收率分别是98.1%和97.2%，具有较好的回收效果。

3 结 论

本研究在传统的Folin-Ciocalteu分光光度法的原理基础上，首次用微波处理，极大的缩短了反应时间。通过优化反应条件，简化测试程序，得到体系的最佳反应条件为0.1mL样品，0.1mL 1mol/L Folin-Ciocalteu试剂和0.8mL 60g/L Na2CO3溶液，在微波炉的中档条件下处理20s后，测定765nm波长处的吸光度。以低质量浓度没食子酸(50mg/L)为标准样品直接作标准曲线，质量浓度在1～50mg/L范围内与吸光度呈良好线性关系(R2=0.9996)。利用该法测定添加没食子酸标准样的葡萄与葡萄酒样，平均回收率分别为98.1%和97.2%，相对标准偏差(RSD)分别为1.40%和1.01%。本法是一种简单、微量、快速测定葡萄与葡萄酒总酚含量的新方法。微波炉加速反应的机制仍需要进一步的研究。

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Rapid and Micro-Determination of Total Polyphenol in Grape and Grape Wine

XU Guo-qian1，ZHANG Zhen-wen1,2,*，GUO An-que1,2，FANG Yu-lin1,2，LUAN Li-ying1
(1. College of Enology, Northwest A & F University, Yangling 712100, China；2. Research Center for Viti-viniculture of Shaanxi Province, Yangling 712100, China)

Based on the principle of Folin-Ciocalteu (F-C) assay for determining total polyphenol in grape and grape wine, a new method was developed by optimizing reactive conditions with the aid of micropipette and microwave irradiation. The optimal conditions were 0.1 mL of sample, 0.1 mL of 1 mol/L F-C reagent and 0.8 mL of 60 g/L Na2CO3, microwave treatment for 20 s at the middle power level, determination wavelength of 765 nm. The standard curve exhibited a good linear relationship between absorbance and gallic acid concentration from 1 to 50 mg/L (R2= 0.9996). When several gallic acid solutions were added to grape and grape wine samples, the average recovery rates of spiked gallic acid in grape and grape wine samples were 98.1% and 97.2%, respectively, with a relative standard deviation (RSD) ranging from 1.40% to 1.01%. This new method is characteristic of simple operation, fast determination, excellent precision, prefect reproducibility and significant reduction in the consumption of samples, reagents as well as time. Therefore, this new method is a promising method for determining total polyphenol in grape and grape wine.

grape；grape wine；total polyphenol；determination；Folin-Ciocalteu assay

TS262.6；Q657.3

A

1002-6630(2010)18-0268-03

2009-12-14

国家现代农业产业技术体系建设专项(nycytx-30-zp-04)

徐国前(1968—)，男，博士研究生，研究方向为葡萄栽培与酿酒。E-mail：xugql@163.com

*通信作者：张振文(1960—)，男，教授，硕士，研究方向为葡萄栽培与酿酒。E-mail：Zhangzhw60@nwsuaf.edu.cn