微波辅助提取马钱子中总生物碱工艺

邹建国，刘 飞，徐小龙，刘燕燕，彭海龙，王海鹏，罗 平

(南昌大学环境与化学工程学院，江西 南昌 330031)

微波辅助提取马钱子中总生物碱工艺

邹建国，刘 飞，徐小龙，刘燕燕，彭海龙，王海鹏，罗 平

(南昌大学环境与化学工程学院，江西 南昌 330031)

采用微波辅助方法提取马钱子中总生物碱，并对其工艺条件进行优化。考察微波辐射功率、微波辐射时间、乙醇体积分数、液料比和微波前预浸泡时间等因素对提取效率的影响，并利用响应面法对其工艺条件进行优化。利用中心组合设计原理及响应面法分析建立二次回归模型，以微波辐射功率、微波辐射时间、乙醇体积分数为自变量，以士的宁、马钱子碱产率的综合指标为响应值，研究各因素及其交互作用对生物碱产率的影响。利用模型的响应曲面图及其等高线图，确定微波辅助提取马钱子中生物碱的最佳工艺参数：微波功率240W、微波辐射时间6.7min、液料比6:1(mL/g)、乙醇体积分数58.8%。在此条件下，士的宁、马钱子碱的提取量分别达到18.97、9.46mg/g，与理论预测值基本吻合。该结果可为马钱子中总生物碱的工业提取提供参考和依据。

马钱子；微波辅助提取；总生物碱；响应面法；响应值

马钱子为马钱科植物马钱(Strychnos nux-vomica L.)或云南马钱 (Strychnos pierriana A.W.Hill)的干燥成熟种子。马钱子在我国药用历史悠久，其性苦味温，归肝脾经，具有通络止痛、散结消肿的功效[1-4]。临床上主要用于风湿顽痹、跌打损伤、小儿麻痹后遗症、类风湿性关节炎、各种神经系统疾病、癌症、慢性支气管炎和慢性再生障碍性贫血等的治疗[5-8]。马钱子药用有效成分为生物碱类，含量为1.5%～5%，其中主要是士的宁，其次是马钱子碱[9-10]。因此，提取分离马钱子生物碱的技术研究，对进一步开发马钱子药用价值和提高其经济效益均具有重要意义。

微波辅助提取技术利用微波能所产生的破壁效应，可将存在于植物细胞内的活性成分较完全的释放出来，具有强力、瞬时、高效、溶剂用量小、萃取效率高等特点[11-12]。本实验将微波辅助提取技术应用于马钱子中生物碱的提取，通过单因素和响应面法试验优化微波

辅助提取马钱子中生物碱的工艺条件，为微波辅助提取马钱子中生物碱的工业化生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

马钱子(经南昌大学制药工程教研室蒋以号博士鉴定)樟树市医药公司市售；士的宁(批号:110705-200306)标准品、马钱子碱(批号:0706-200104)标准品 中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯；实验用水为二次蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

MCL-3型微波提取装置 四川大学无线电系改装；LC-10AT型高效液相色谱仪 日本岛津公司；FZ-102微型植物粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；FA2104型电子天平 上海伦捷机电仪表有限公司；TDL-4型离心机 杭州汇尔仪器设备有限公司；SHB-ⅢB型循环水式真空泵 上海仪表集团供销公司；SENCO型旋转蒸发仪 上海申生科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 微波辅助提取马钱子中总生物碱

精密称取经粉碎、筛分、干燥的马钱子生品5.0g，置100mL圆底烧瓶中，加入一定量的提取剂，预浸泡一定时间后，在给定的实验条件(微波功率、微波提取时间、液料比和乙醇体积分数等)下，微波辅助提取马钱子中总生物碱。提取液经过滤，用相应体积分数乙醇溶液定容至100mL。准确吸取该提取液10mL，置旋转蒸发仪中减压浓缩，用2倍量无水乙醇溶解样品，低速离心机2000r/min离心20min，取上清液，用无水硫酸钠脱水，过滤，无水乙醇定容至25mL。用0.45μm滤膜过滤后供HPLC检测，计算出生物碱提取量。

通过单因素试验，分别考察样品粒径、液料比、乙醇体积分数、溶剂pH值、微波前预浸泡时间、微波功率和微波提取时间等因素对马钱子中总生物碱提取效率的影响，初步选定其最佳工艺条件。再在单因素试验的基础上，选取微波功率、微波提取时间、乙醇体积分数三个对马钱子有效成分提取效果影响较大的因素，进行响应面分析，对提取工艺进行优化。

1.2.2 分析检测方法

1.2.2.1 色谱条件

Shimadzu VP-ODS色谱柱(150mm×4.6mm，4.6μm)；检测波长：254nm，柱温：30℃，流动相：A(78%)为水-乙酸-三乙胺(230:2.4:0.3)；B(22%)为甲醇；流速：1.0mL/min，收集时间：25min。在该色谱条件下士的宁和马钱子碱的保留时间分别为9.5min和13.2min。

1.2.2.2 标准曲线绘制

准确称取经干燥至质量恒定的士的宁、马钱子碱标准品7.1mg和6.5mg，移入25mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配得混合对照品溶液。分别取该标准溶液2、4、6、8、10μL准确进样，以色谱峰面积(Y)和进样量(X)进行回归。

1.2.2.3 精密度和回收率实验

精密吸取上述对照品溶液5μL，注入液相色谱仪，重复进样6次，分别计算其RSD值。

采用加样回收法，精密量取已知含量的样品3份，加入对照品溶液适量，按样品测定项下方法操作，计算回收率。

1.2.3 工艺评价指标

多指标综合评判不拘泥于某化学成分或适合纯化学成分的药理模型，而是考虑综合成分作用，并进行优选工艺。按照中心组合设计表的条件进行试验，分别测得士的宁、马钱子碱提取量，并进行多指标综合评分。评分时以各指标的最大值为参照将数据进行归一化，再给出不同的统计权重[13]。在本实验中其权重系数均设为0.5。其工艺评价指标如下式所示：

2 结果与分析

2.1 分析检测结果

标准品、供试品HPLC色谱图，见图1、2。以标准品色谱峰面积(Y)和进样量(X)进行回归得出士的宁和马钱子碱的回归方程，见表1。精密度实验计算出RSD分别为：士的宁1.21%，马钱子碱1.33%，都小于2%，表明仪器精密度良好。回收率实验表明：士的宁和马钱子碱的平均回收率分别达到98.24%和97.60%(表2)。

表1 士的宁和马钱子碱的回归方程Table 1 Standard equations of strychine and brucine

图1 标准品HPLC色谱图Fig.1 Chromatograms of strychine and brucine standards

图2 供试品HPLC色谱图Fig.2 Chromatograms of the extract from Semen Strychni

表2 加样回收率实验结果(n=3)Table 2 Spike recoveries for strychine and brucine (n=3)

2.2 单因素试验结果

根据单因素试验条件，在影响马钱子有效成分提取的工艺条件中，初步选定马钱子粒度20～40目，液料比(mL/g)6:1，乙醇体积分数50%，微波前预浸泡时间30min，微波辐射功率240W，微波辐射时间6.0min作为最佳提取条件。

2.3 响应面分析法优化提取工艺条件

2.3.1 响应面分析方案及试验结果

表3 试验因素水平表Table 3 Factors and levels in the central composite design

表4 响应面分析方案及结果Table 4 Central composite design matrix and experimental results

根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，综合单因素试验结果，精密称取5.0g马钱子样品于圆底烧瓶中，选取微波功率(X1)、微波提取时间(X2)、乙醇体积分数(X3)对马钱子有效成分提取量影响显著的3个因素进行响应面试验设计，优化马钱子中生物碱的提取工艺，其具体试验方案及结果见表3、4。

2.3.2 模型的建立及其显著性检验

将上述试验结果进行三元非线性回归分析，可得如下回归方程：

Y = 99.24+1.329X1+4.513X2+0.4862X3－1.393X1X2－0.255X1X3+1.733X2X3－13.75X12－7.005X22－1.562X32

表5 回归模型各项的方差分析Table 5 Analysis of variances for each term of the developed regression model

回归方程中各因子与响应值之间线性关系的显著性，可由F值检验来判定。从表5可以看出，各因素中X1、X2、X12、X22为显著性(P＜0.05)影响因素。在各单因素中，微波提取时间(X2)对响应值的影响最大，其次是微波功率(X1)和乙醇体积分数(X3)。模型的F=55.49＞F0.01(9,5)，表明该回归方程具有高度的显著性，其相关系数R2=0.9901，说明响应值的变化有99.01%来源于所选因素。失拟项F值为5.277，表明失拟项相对于绝对误差不显著。因此，该模型能很好地描述试验结果，可以用此模型对马钱子中生物碱的提取效果进行分析[14]。

2.3.3 提取工艺的响应曲面分析与优化

图3～5直观地反映了各因素交互作用对响应值的影响。比较3组图可知：微波功率、微波提取时间对马钱子提取效果的影响最为显著，曲线较陡；而乙醇体积分数对响应值的影响较小，曲线较为平滑，其数值的增加或减少，对响应值变化较小。

通过对回归方程求一阶偏导，可以求出模型的极值点为微波功率243.2W、提取时间6.727min、乙醇体积分数58.84%。但考虑到实际操作和节省能源将马钱子提

取工艺条件调整为微波功率240W、提取时间6.7min、乙醇体积分数58.8%。在此条件下，实际测得士的宁、马钱子碱的提取量平均值分别达到18.97mg/g和9.46mg/g，综合指标为100.5，与理论预测值基本吻合，说明采用响应面法优化得到的微波辅助提取条件参数准确可靠，具有一定实用价值。

图3 Y=f(X1,X2)的响应面和等高线图Fig.3 Response surface and contour plots of Y=f(X1,X2)

图4 Y=f(X1,X3)的响应面和等高线图Fig.4 Response surface and contour plots ofY=f(X1,X3)

图5 Y=f(X2,X3)的响应面和等高线图Fig.5 Response surface and contour plots of Y=f(X2,X3)

2.4 微波辅助提取与热回流提取技术的比较

按实验得到的微波辅助提取最佳工艺条件进行马钱子有效成分的提取实验，并与热回流提取[15]实验进行对比，结果如表6所示。

表6 微波辅助提取与热回流提取方法比较Table 6 Comparisons on strychnine and strychnine yields and processconditions between this method and hot reflux extraction

由表6可知：微波辅助提取的士的宁提取量与热回流提取相差不大，而马钱子碱提取量则高于热回流提取过程，具有提取效率高，提取剂用量省，提取时间大大缩短等优势。从节能、省时和溶剂消耗等多方面来看，微波辅助提取工艺更适于马钱子中生物碱的提取。

3 结 论

3.1 将微波辅助提取技术应用于马钱子中生物碱的提取，通过单因素和响应面法试验优化微波辅助提取马钱子中生物碱工艺条件，其最佳工艺参数为：微波功率240W、微波辐射6.7min、液料比6:1(mL/g)、乙醇体积分数58.8%。在此条件下，士的宁、马钱子碱提取量分别为18.97mg/g和9.46mg/g。实验验结果可为该技术的工业应用提供参考和依据。

3.2 与传统热回流提取技术相比，微波辅助提取马钱子中总生物碱技术具有提取效率高，提取剂用量少，提取时间短，能源消耗低等特点。

[1]朱燕娜, 常宇明, 鲍梦周, 等. 马钱子碱对小白鼠的中枢作用[J]. 河南医科大学学报, 1992, 27(2): 140-142.

[2]朱建伟, 武继彪, 李成韶, 等. 马钱子碱镇痛作用及其药效动力学研究[J]. 中国中医药科技, 2005, 12(3): 166-167.

[3]YIN Wu, WANG Tianshan, YIN Fangzhou, et al. Analgesic and antiinflanmmatory properties of brucine and brucine N-oxide extracted from seeds of Strychnos nux-vomica[J]. Ethnophamacol, 2003, 88(2/3): 205-214.

[4]魏世超, 徐丽君, 张秀桥. 马钱子总生物碱对大鼠佐剂性关节炎的作用[J]. 中国药理学通报, 2001, 17(4): 479-480.

[5]DENG Xukun, YIN Wu, LI Weidong, et al. The anti-tumor effects of alkaloids from the seeds of Strychnos nux-vomica on HepG2 cells and its possible mechanism[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2006, 106(2): 179-186.

[6]YIN Wu, DENG Xukun, YIN Fangzhou, et al. The cytotoxicity induced by brucine from the seed of Strychnos nux-vomica proceeds via apoptosis and is mediated by cyclooxygenase 2 and caspase 3 in SMMC 7221 cells [J]. Food Chem Toxicol, 2007, 45(9): 1700-1708.

[7]CAI Baochang, SHI Zhiyang. Processing nux-vomica V. Protective effects of strychnos alkaloids on the xanthine and xanthine oxidase induced damage to culturted Cardio-My-cytes[J]. Traditional Medicine, 1995, 49(1): 39-46.

[8]邓旭坤, 蔡宝昌, 殷武, 等. Brucine对Heps荷瘤小鼠的抗肿瘤作用和毒性的研究[J]. 中国药理学通报, 2006, 22(1): 35-39.

[9]马密霞, 胡文祥, 刘接卿, 等. 马钱子属植物的药理毒理作用及临床应用进展[J]. 中国医院药学杂志, 2007, 27(12): 1725-1728.

[10]殴明, 林励, 李衍文. 简明中药成分手册[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2003: 50-51．

[11]肖桂青, 方俊, 卢向阳, 等. 微波辅助提取荷叶总生物碱的工艺研究[J]. 天然产物研究与开发, 2008, 20(5): 918-921.

[12]DENG Chunhui, LIU Ning, GAO Mingxia, et al. Recent developments in sample preparation techniques for chromatography analysis of traditional Chinese medicines[J]. J Chromatogr A, 2007, 1153(1/2): 90-96.

[13]李丽, 周军, 张莹, 等. 多指标综合评分法优化痛风宁颗粒提取工艺[J]. 中成药, 2007, 29(2): 281-283.

[14]杜玉兰, 黎庆涛, 王远辉. 响应曲面法优化鼠尾藻中脂质的提取工艺[J]. 天然产物研究与开发, 2008, 20(6): 1091-1094.

[15]段晓颖. 正交试验法优选马钱子醇提工艺研究[J]. 中国现代应用药学杂志, 2007, 24(5): 375-377.

Optimization of Microwave-assisted Extraction of Total Alkaloids from Semen strychni

ZOU Jian-guo，LIU Fei，XU Xiao-long，LIU Yan-yan，PENG Hai-long，WANG Hai-peng，LUO Ping
(School of Environmental and Chemical Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China)

Microwave was applied to the extraction of total alkaloids from semen Strychni, the dry ripe seeds of Strychnos nuxvomica L. and the extraction process was optimized in this study. Firstly, single factor studies were conducted to investigate the effects of microwave power and irradiation time, ethanol concentration, liquid/solid ratio and pre-microwave irradiation soaking time on total alkaloids yield. Subsequently, central composition design and multiple nonlinear regression analysis were employed to establish a mathematical model describing total alkaloids yield as a function of the above extraction conditions. Finally, the pairwise interactive effects of these extraction conditions on total alkaloids yield were examined based on response surface and contour plots. The optimal extraction conditions were determined as follows: microwave power 240 W, extraction time 6.7 min, liquid/solid ratio 6:1, ethanol concentration 58.8%. An experimental strychnine yield of 18.97 mg/g and an experimental brucine yield of 9.46 mg/g were obtained under such conditions, which were substantially consistent with their respective theoretical counterparts.

Semen strychni；microwave-assisted extraction；total alkaloids；response surface methodology；response value

R284.2；Q946.91

A

1002-6630(2010)18-0116-04

2010-06-29

江西省自然科学基金项目(2007GZH1924)

邹建国(1957—)，男，教授，博士，研究方向为精细化工、天然产物有效成分的提取与分离。E-mail：Jianguozou@163.com