驴乳中蛋白质组分的分离纯化与鉴定

苏 薇，杨 洁*，沈晓丽，蒋新月

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046)

驴乳中蛋白质组分的分离纯化与鉴定

苏 薇1，杨 洁2,*，沈晓丽3，蒋新月3

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046)

目的：分离纯化并鉴定驴乳乳清中蛋白质组分，为进一步研究驴乳用于辅助治疗疾病，以及为作为人乳替代品提供参考。方法：采用DEAE-52离子交换层析和Sephadex G-100凝胶层析分离纯化驴乳乳清中蛋白质组分，并通过十二烷基硫酸钠——聚丙烯酰胺凝胶电泳法和高效凝胶渗透色谱法对所纯化蛋白质进行鉴定。结果：与牛乳乳清中蛋白组分相对比，发现驴乳乳清中存在3种未知蛋白质，分子质量分别为32、70.1、72.2kD。结论：驴乳中除了含有与牛乳相似的营养成分外，还具有其他生物活性成分，它们可能是一些保护性蛋白，在机体的抗病机制方面起着重要作用。

驴乳；蛋白质组分；分离；纯化

近年来，驴乳因其独特的营养价值，已成为一种值得开发的宝贵资源，并作为一种新兴的乳品引起了世界奶业研究人员的关注。有研究表明，驴乳具有很高的营养价值和药用价值，可作为牛乳蛋白过敏患者及婴幼儿的营养品，并可以辅助治疗动脉硬化，促进心血管疾病患者的康复[1-2]。驴乳中溶菌酶和乳糖的含量较高，有益于益生乳酸杆菌的生长，高含量的乳糖能促进肠对钙的吸收，有利于在婴幼儿时期骨骼的生长[3]。驴乳中脂质组成与人乳相似，其中亚油酸和亚麻酸含量较高[4-5]。同时，驴乳中矿物质含量和蛋白质总量也接近人乳和马乳[6-7]。因而，驴乳的开发利用有着巨大的经济价值和社会价值。

本实验采用DEAE-52离子交换层析和Sephadex G-100凝胶层析分离纯化驴乳乳清中蛋白质组分，并通过十二烷基硫酸钠——聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)对所纯化蛋白质进行鉴定。以期为新疆驴乳用于辅助治疗疾病，以及作为人乳替代品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

驴乳采自新疆乌鲁木齐市郊区，-2 0℃储藏；DEAE-52纤维素 Whatman公司；Sephadex G-100 Pharmacia公司；Fermentas非预染Marker 上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 仪器与设备

BioLogic Lp层析系统 美国Bio-Rad公司；真空冷冻干燥机 德国贺利氏公司；Heal Force NW系列超纯水系统 上海力新仪器有限公司；Mini ProteinII 垂直电泳系统 美国Bio-Rad公司；Alphalmager2200凝胶处理及分析系统 AlphaInnotech公司。

1.3 方法

1.3.1 驴乳蛋白的粗分[8]

驴乳4℃解冻，10000r/min离心15min脱脂。

脱脂乳与2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液等体积混合，用10%乙酸调pH 4.6，40℃水浴20min，8000r/min离心15min，收集上清液(乳清)，冻干、备用。沉淀(酪蛋白)用蒸馏水冲洗3次，冻干，备用。

1.3.2 离子交换层析分离驴乳乳清蛋白[9]

称取冻干乳清粉约0.3g溶于5mL蒸馏水中，5000r/min离心10min，取上清液0.45μm微孔滤膜过滤，滤液加入DEAE-52层析柱(1.5cm×20cm)，用0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8) 洗脱未被吸附的蛋白质，用含0.1～0.4 mol/LNaCl的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8)连续洗脱被吸附的蛋白质，洗脱速度为0.5mL/min。收集洗脱峰，透析、冻干、备用。

1.3.3 十二烷基硫酸钠——聚丙烯酰胺凝胶电泳

将DEAE-52离子交换层析收集所得蛋白质洗脱峰的冻干粉，进行非连续SDS-PAGE凝胶电泳，浓缩胶5%，分离胶为12%，恒流电流为15mA，电泳时间为1～2h。当染料距底边1cm时，停止电泳。经染色、脱色，将凝胶放入Alphalmager2200凝胶处理及分析系统中照相。

1.3.4 凝胶层析分离纯化蛋白

Sephadex G-100层析柱(1.6cm×55cm)用0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8)平衡，洗脱速度为0.5mL/min，取DEAE-52柱层析的各洗脱峰收集所得蛋白冻干粉10mg分别溶于3mL磷酸盐缓冲液，5000r/min离心10min，0.45μm微孔滤膜过滤，上样，收集洗脱峰，透析，冻干，备用。

1.3.5 高效凝胶渗透色谱(HPGPC)[10]

采用TOSOH TSK-G4000PWXL (300mm×7.8mm)色谱柱对Sephadex G-100凝胶层析所得蛋白质洗脱峰的冻干粉进行检测，流速为0.5mL/min，流动相为0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.9)，检测波长为280nm，进样量为20μL。

标准蛋白的制备：标准蛋白(牛免疫球蛋白G：170 kD；甘氨酸氧化酶：150 kD；牛血清白蛋白：66.2 kD；卵清蛋白：45.0kD；胰蛋白酶：24kD；溶菌酶：14.4kD)分别溶于0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.9)，质量浓度为1mg/mL，离心，0.22μm微孔滤膜过滤，加入TOSOH TSK-G4000PWXL (300mm×7.8mm)色谱柱进行检测。

2 结果与分析

2.1 驴乳乳清蛋白的离子交换层析图谱分析

图1 乳清蛋白的DEAE-52离子交换层析图Fig.1 DEAE-52 chromatographic fractionation of donkey s milk whey proteins

由图1可知，DEAE-52离子交换层析对驴乳乳清蛋白进行分离纯化，出现11个蛋白质峰。用0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8)洗脱，得到5个洗脱峰，即峰A、B、C、D、E；用含0.1～0.4mol/LNaCl的0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8)连续洗脱，得到6个洗脱峰，即峰F、G、H、I、J、K。

2.2 离子交换层析的SDS-PAGE电泳图谱分析

图2 DEAE-52离子交换层析各蛋白质峰的SDS-PAGE电泳图Fig.2 SDS-PAGE of protein fractions of donkey s milk whey obtained after DEAE-52 chromatographic fractionation

通过SDS-PAGE凝胶电泳检测DEAE-52离子交换层析所得蛋白组分(图2)，结果表明，只有峰G出现了一条单一蛋白条带。而其余各峰均出现多条蛋白条带，故需对所得蛋白质组分进一步分离纯化。

2.3 凝胶层析分离纯化蛋白图谱分析

由于从DEAE-52离子交换层析收集所得蛋白组分得率较低，故只对部分蛋白组分进行Sephadex G-100凝胶层析。图3～8为驴乳乳清蛋白经DEAE-52离子交换层析所得部分洗脱峰的Sephadex G-100凝胶层析图。峰A、H、I、K的洗脱曲线为单一峰(图3、6、7、8)，命名为A1、H1、I1、K1。峰F存在2个洗脱峰(图4)，说明其中存在2个不同分子量的蛋白组分F1、F2。峰G存在1个洗脱峰(图5)，说明峰G为单一蛋白组分。峰J存在3个洗脱峰(图7)，说明其中存在3个不同分子量的蛋白组分，分别命名为J1、J2、J3。

图3 峰A的Sephadex G-100凝胶层析图Fig.3 Sephadex G-100 gel-filtration chromatographic purification of protein peak A

图4 峰F的 Sephadex G-100凝胶层析图Fig.4 Sephadex G-100 gel-filtration chromatographic purification of protein peak F

图5 峰G的Sephadex G-100凝胶层析图Fig.5 Sephadex G-100 gel-filtration chromatographic purification of protein peak G

图6 峰H的Sephadex G-100凝胶层析图Fig.6 Sephadex G-100 gel-filtration chromatographic purification of protein peak H

图7 峰J和I的Sephadex G-100凝胶层析图Fig.7 Sephadex G-100 gel-filtration chromatographic purification of protein peaks J and I

图8 峰K的Sephadex G-100凝胶层析图Fig.8 Sephadex G-100 gel-filtration chromatographic purification of protein peak K

2.4 蛋白质分子质量的确定

根据5种标准蛋白质分子质量的对数值与TOSOH TSK-G4000PWXL(300mm×7.8mm)色谱柱中保留时间之间的线性相关关系，用Excel软件绘制标准曲线为y=-0.0678x+2.9999，R2=0.9802。

SephadexG-100凝胶层析分离出部分蛋白组分的HPGPC图谱(图9～11)，根据标准蛋白质的标准曲线，可计算出洗脱峰中蛋白组分的分子质量，最终确定蛋白组分分子质量大小及相对应牛乳乳清中蛋白质名称见表1。

图9 峰A1、F1和G1的HPGPC图谱Fig.9 HPGPC profiles of protein peaks A1, F1and G1

图10 峰H1、I1和K1的HPGPC图谱Fig.10 HPGPC profiles of protein peaks H1, I1and K1

图11 峰J1、J2和J3的HPGPC图谱Fig.11 HPGPC profiles of protein peaks J1, J2and J3

表1 驴乳乳清中蛋白质分子质量及相对应牛乳乳清中蛋白质Table 1 Identification of separated protein fractions of donkey s milk whey based on molecular mass alignment with cow s milk whey

由表1可以看出，峰A1中蛋白组分的分子质量接近于溶菌酶，峰F1和峰J2中蛋白组分的分子质量接近于牛血清白蛋白，峰H1和峰J3中蛋白组分的分子质量接近于β-乳球蛋白，峰K1中蛋白组分的分子质量接近于α-乳白蛋白。与牛乳乳清中蛋白组分相对比，发现驴乳乳清中存在3种未知蛋白质，分子质量分别为32、70.1、72.2kD。

3 结 论

驴乳作为一个新的研究领域，国内外研究主要集中在理化指标和营养特性等方面。Piccione等[11]发现驴乳中营养成分的日变化存在一定规律，脂肪和乳糖含量在夜晚达到高峰，而蛋白质含量在白天达到高峰。Vincenzetti等[12]对驴乳中蛋白质成分进行研究，发现驴

乳与其他乳类相比有低酪蛋白含量和高溶菌酶含量的营养特性。张岩春等[13]通过对驴乳与牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量进行比较，发现驴乳中α-乳白蛋白含量较高。张晓莹等[14]对50头新疆疆岳驴乳的化学成分以及微生物指标进行分析，结果表明，与牛乳相比驴乳各项指标更接近人乳。Criscione等[15]研究发现西西里岛的驴乳中缺乏αs1-酪蛋白。Mao等[16]研究发现驴乳乳清蛋白中一些活性蛋白质组分对人肺癌细胞A549具有抗增生和抗肿瘤的作用，其分子质量大于10 kD，这些活性蛋白质组分能促进细胞分泌白细胞介素-2、干扰素-γ、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-β。驴乳中活性蛋白质组分不仅能直接抑制肿瘤增生，还可通过激活淋巴细胞和巨噬细胞间接杀死肿瘤细胞。

本研究针对新疆驴乳经脱脂，等电点沉淀，分离得到乳清蛋白，采用DEAE-52纤维素层析和SephadexG-100凝胶层析分离出蛋白组分，并利用SDS-PAGE凝胶电泳和高效凝胶过滤色谱对所纯化蛋白质进行鉴定。通过与牛乳乳清中蛋白质相对比，发现新疆驴乳中存在3种未知蛋白质，分子质量分别为32 、70.1kD和72.2 kD。这说明驴乳中除了含有与牛乳相似的营养成分外，还具有其他生物活性成分，它们可能是一些保护性蛋白，在机体的抗病机制方面起着重要作用。对于本实验结果可以为深入系统地研究驴乳中的生物活性成分，并确定其药用机理，以及开发驴乳产品，提高驴乳的利用价值等提供科学依据。也为阐明驴乳保护性蛋白含量及其生物学活性的独特性，为驴乳保护性蛋白的新资源奠定基础。

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Purification and Identification of Donkey ,s Milk Protein Fractions

SU Wei1，YANG Jie2,*，SHEN Xiao-li3，JIANG Xin-yue3
(College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046,China)

Objective: To provide a theoretical basis for further exploring the exploitability of donkey milk as an adjuvant for disease treatment or as a substitute for human milk. Methods: The protein fractions of donkey whey were separated and purified by DEAE-52 anion-exchange chromatography and Sephadex G-100 gel-filtration chromatography. The purified protein fractions were identified by SDS-PAGE and high-performance gel permeation chromatography. Results: Three unknown proteins having molecular masses of 32, 70.1 kD and 72.2 kD were found to be present in donkey whey in comparison with the protein composition profile of cow s milk whey. Conclusion: Along with the similar nutritional components to those in cow s milk, other bioactive components were also contained in donkey s milk, which might be some protective proteins playing an important role in protecting the organism against diseases.

donkey s milk；protein fraction；separation；purification

TS252

A

1002-6630(2010)23-0044-05

2010-09-28

苏薇(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为生化工程。E-mail：suwei658@sina.com

*通信作者：杨洁(1963—)，女，副教授，博士研究生，研究方向为生物化学。E-mail：xindayangjie@sina.com