高效液相色谱-蒸发光散射法测定奶制品中动物水解蛋白

赵燕燕，刘丽艳，杜光玲，韩媛媛，白 洁，耿成光，高 茜

(1.河北大学医学实验中心，河北 保定 071000；2.河北大学化学与环境科学学院，河北 保定 071000)

高效液相色谱-蒸发光散射法测定奶制品中动物水解蛋白

赵燕燕1,2，刘丽艳2，杜光玲1，韩媛媛1，白 洁1，耿成光2，高 茜2

(1.河北大学医学实验中心，河北 保定 071000；2.河北大学化学与环境科学学院，河北 保定 071000)

目的：建立高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)测定奶制品中动物水解蛋白含量的方法。方法：奶制品用酸水解法进行处理。采用色谱柱：Shim-pack C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相 3.8mmol/L七氟丁酸溶液-甲醇(8:2，V/V)，流速 1.0mL/min，ELSD漂移管温度 50℃，载气压力 350kPa，进样量10μL，测定奶制品中羟脯氨酸(Hyp)。结果：在优化条件下，羟脯氨酸的线性范围为10～1000μg/mL，r=0.99993(n=5)，最低检出限为5μg/mL。动物水解蛋白的平均回收率为99.83%，RSD为2.77%。结论：本法不需对样品进行衍生，操作简单，灵敏度高，结果准确，可用于羟脯氨酸的分离检测。

高效液相色谱；蒸发光散射检测器；奶制品；动物水解蛋白；羟脯氨酸

奶制品中乳蛋白是一种全价蛋白，由18种以上氨基酸组成，是乳营养中最重要成分之一，其含量已成为目前控制奶制品质量标准的主要指标。有些非法厂家将动物水解蛋白质掺入奶制品中以提高蛋白质的标示量，降低了奶制品的营养价值，影响了质量、卫生以及口味[1]。市场上常用的动物水解蛋白为鱼皮胶原蛋白、羊皮水解蛋白粉、牛皮水解蛋白粉、骨水解蛋白粉，经酸水解后释放出羟脯氨酸(Hyp)。羟脯氨酸是动物水解蛋白所特有的氨基酸，为非人体必需氨基酸，含量相对稳定，在正常动物水解蛋白中含量约13.4%，为检测动物水解蛋白含量的主要指标。目前羟脯氨酸的测定方法主要有比色法[2]、氨基酸分析仪法[3-4]、高效液相色谱-荧光检测器法[5-6]、气相色谱法[7-8]、毛细管电泳法[9-10]、LC-MS/MS[11]、超声乳成分分析仪法[12]、质谱法[13]。比色法特异性、灵敏度、准确度较差，测定结果易受多种因素影响；氨基酸分析仪价格昂贵，难以推广；色谱法测定，样品需要衍生，操作繁琐。采用高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)法测定羟脯氨酸的方法尚未见文献报道。本实验采用HPLC-ELSD法测定羟脯氨酸，计算奶制品中动物水解蛋白含量。样品不经衍生，操作简便、快捷，避免了衍生物的多样性，以及样品中氨基酸衍生不完全等问题，对羟脯氨酸直接进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

奶制品 市售。

羟脯氨酸标准品(批号：H54409)、七氟丁酸(色谱纯，批号：24364323) Sigma公司；鱼皮胶原蛋白(批号：090812)、骨水解蛋白粉(批号：090725) 梁山科泰生物制品有限公司；三氯乙酸(色谱纯，批号：20090225) 科密欧试剂公司；甲醇、乙腈(色谱纯)；其他试剂均为分析纯。实验用水为二次去离子水。

1.2 仪器与设备

LC-10ATVP高效液相色谱仪、ELSD-LTⅡ蒸发光散射检测器、CLASS-VP工作站、ODS分析柱 日本岛津公司；DELTA-320型酸度计 梅特勒-托利多仪器有限公司；CU-600型电热恒温水槽 上海一恒科技有限公司；超纯化水机 重庆颐洋企业发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件和ELSD参数

色谱柱Shim-pack C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：3.8mmol/L七氟丁酸溶液-甲醇(8:2，V/V)；流速1.0mL/min；进样量10μL；ELSD漂移管温度50℃；氮气做载气；载气压力350kPa。

1.3.2 储备液配制

精密称取羟脯氨酸对照品0.0250g置于25mL容量瓶中，加入适量二次去离子水，振摇使溶解，定容至刻度，制成质量浓度1000μg/mL的对照品储备液，于4℃冰箱中保存备用。

1.3.3 样品处理

取液态奶2.5mL于水解管中，加入等体积的浓盐酸，充氮后封管，置于110℃烘箱中保持6h，冷却后经布氏漏斗过滤到50mL锥形瓶中，置于水浴锅中蒸干，加二次去离子水，再蒸干，重复5次，残渣用二次去离子水定容到50mL容量瓶中，0.45μm滤膜过滤，上机分析。

1.3.4 动物水解蛋白含量的测定

动物水解蛋白经酸法水解处理释放出羟脯氨酸，通过以下公式计算其转化率[14]：

式中：m1为羟脯氨酸含量；m2为动物水解蛋白含量。

羟脯氨酸转化率与动物水解蛋白在奶制品中的含量之间的换算系数f[14]：

由f计算奶制品中动物水解蛋白含量：m2= f×m1。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

考察不同流动相(10.0mmol/L三氯乙酸溶液-乙腈、10.0mmol/L三氯乙酸溶液-甲醇、醋酸盐缓冲溶液-10.0mmol/L三氯乙酸溶液-乙腈，4.0mmol/L七氟丁酸溶液-甲醇)对样品中各组分分离度以及灵敏度的影响，结果表明：采用4.0mmol/L七氟丁酸溶液-甲醇为流动相分离效果较好，Hpy峰与其他峰之间达到基线分离。

分别按七氟丁酸和甲醇混合溶液(8:1、8:2、8:3，V/V)以及七氟丁酸溶液的浓度(3.0、3.4、3.8、4.2mmol/L)进行考察，结果表明：随着甲醇比例的加大，分离度与灵敏度均增加，但当4.0mmol/L七氟丁酸溶液与甲醇的比例大于8:2时，柱压加大，会影响柱子的使用寿命，所以4.0mmol/L七氟丁酸与甲醇的比例为8:2时，较为适宜；流动相中七氟丁酸的浓度对峰型有较大影响，以3.8mmol/L时效果最佳。此时，各色谱峰对称性好，峰型尖锐。因此，综合选择流动相3.8mmol/L七氟丁酸溶液-甲醇为8:2较为适宜。

2.2 检测器参数的选择

蒸发光散射检测器的漂移管温度和气体流量是影响检测结果的重要参数[15-16]。分别考察漂移管温度(40、50、60℃)和氮气压力(350、380、400kPa)对检测结果的影响。结果表明：漂移管温度低于50℃时，流动相得不到充分的挥发，基线水平较高，而温度高于50℃时，会带来较大的噪音；随着载气流量的增大，响应值随之减小。在漂移管温度50℃、载气压力350kPa时，基线平稳、噪声较小、有适宜的响应值。因此，最终选择此参数进行测定。

2.3 方法专属性实验

分别取4份同一批次、同一品牌的液态奶各25mL，一份空白奶作为对照，另外3份分别加入0.0078g羟脯氨酸、0.7720g骨水解蛋白粉和0.7720g鱼皮胶原蛋白，分别按1.3.3节方法进行处理，上机分析，其色谱图见图1。

图1 牛奶中羟脯氨酸检测色谱图Fig.1 HPLC profiles showing the separation of hydroxyproline in blank milk samples unfortified and fortified with hydroxyproline standard, fish skin collagen or hydrolyzed fish bone protein

2.4 线性关系和检出限

精密量取羟脯氨酸对照品适量，配制成一系列质量浓度不同的溶液(1000、500、250、100、50、25、10、5μg/mL)，按照1.3.1节色谱条件进样分析，以质量的对数值(X)为横坐标，以峰高的对数值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，羟脯氨酸线性方程为：Y=1.23681X+ 4.39134(r=0.99993)，线性范围为10～1000μg/mL。按3倍信噪比计算最低检出限(LOD)为5μg/mL。

2.5 精密度实验

取羟脯氨酸对照品储备液适量，将其稀释到浓度为250μg/mL，按照1.3.1节条件进行测定，连续进样6次。结果表明：羟脯氨酸色谱峰的保留时间波动小于0.02min，峰高的相对标准偏差(RSD)为0.91%。

2.6 重现性实验

取6份同一批次、同一品牌的液态奶25mL，分别加入一定量的羟脯氨酸对照品，按照1.3.1节条件进行测定，羟脯氨酸峰高的RSD为2.60%。

2.7 稳定性实验

精密量取一定量羟脯氨酸对照品，用某品牌液态奶溶解并定容到25mL，按照1.3.3节方法进行处理，在0、6、12、24h，2、3、10、20d，1个月时进样，羟脯氨酸峰高的RSD为0.73%，说明样品溶液在一个月内稳定性良好。

2.8 回收率实验

分别取3份同一批次、同一品牌的液态奶各25mL，分别加入不同量的羟脯氨酸对照品，按照1.3.3节方法进行处理，上机分析。羟脯氨酸的加样回收率见表1，平均回收率达99.83%，RSD为2.77%。

表1 羟脯氨酸的加样回收率(n=9)Table1 Average spike recovery and RSD for hydroxyproline (n=9)

2.9 换算系数的计算

分别在50mL液态奶中添加骨水解蛋白粉和鱼皮胶原蛋白，按照1.3.3节方法进行处理，按照1.3.4节方法计算动物水解蛋白中羟脯氨酸的平均转换率和换算系数(f)，结果见表2、3。

表2 骨水解蛋白中羟脯氨酸的转化率和换算系数Table2 Average conversion rate and factor for hydroxyproline in hydrolyze bone protein

表3 鱼皮胶原蛋白中羟脯氨酸转化率和换算系数Table3 Average conversion rate and factor for hydroxyproline in fish skin collagen

2.10 样品测定

按照1.3.3节方法对几种市售不同品牌的牛奶进行处理，上机分析，测得结果见表4。结果表明：样品C、D、F中均含有羟脯氨酸，其中含有的动物水解蛋白的量由其种类决定。含有动物水解蛋白的某品牌牛奶的HPLC-ELSD色谱图见图2。

表4 市售液态奶的测定结果Table4 Results of determination of different brands of liquid milk by the method

图2 含有动物水解蛋白某品牌牛奶的HPLC-ELSD色谱图Fig.2 HPLC profile of some brand of liquid milk containing hydroxyproline

3 结 论

利用高效液相色谱-蒸发光散射检测器，能够准确的测定奶制品中羟脯氨酸的含量，计算出动物水解蛋白的掺加量。本方法不需对样品进行衍生，可以对羟脯氨酸直接进行分析，避免了衍生物的多样性，也不涉及样品中氨基酸衍生不彻底等问题，操作简单，灵敏度高，结果准确，能快速、准确的判断奶制品中是否添加了动物水解蛋白。

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Determination of Hydrolyzed Animal Protein in Dairy Products by High-performance Liquid Chromatography with Evaporative Light Scattering Detection

ZHAO Yan-yan1,2，LIU Li-yan2，DU Guang-ling1，HAN Yuan-yuan1，BAI Jie1，GENG Cheng-guang2，GAO Qian2
(1. Medical Experimental Center, Hebei University, Baoding 071000, China；2. College of Chemistry and Environmental Science, Hebei University, Baoding 071000, China)

Objective: To develop a high-performance chromatographic method with an evaporative light scattering detector (ELSD) for the quantified determination of hydrolyzed animal protein in dairy products. Methods: Acidic hydrolysis was employed for sample pretreatment. The chromatographic column used for analyte separation was Shim-pack C18(4.6 mm × 250 mm, 5μm) with 3.8 mmol/L heptafluorobutyric acid/methanol (8:2, V/V) as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min. The ELSD drift temperature was set at 50 ℃, and the carrier gas pressure at 350 kPa. The sample load of 10μL was adopted. The content of hydroxyproline determined under these conditions was used to characterize the level of hydrolyzed animal protein in samples. Results: The developed method displayed good linearity over the concentration range of 10 to1000μg/mL, with a determination coefficient of 0.99993 (n = 5) and its detection limit was 5μ g/mL. The average spike recovery for hydroxyproline was 99.83%, with 2.77% RSD. Conclusion: This method without sample derivatization has the benefits of simplicity of operation as well as high sensitivity and accuracy, and is applicable for the determination of hydroxyproline.

HPLC；evaporative light scattering detector；dairy products；hydrolyzed animal protein；hydroxyproline

O657.72

A

1002-6630(2010)20-0282-04

2010-01-09

河北省科技攻关项目(05276101D-88)；河北省教育厅科学研究计划项目(y2009315)；河北省卫生厅医学科学研究重点课题(05015；20090570)；河北省中医药管理局科研计划课题(2008072)

赵燕燕(1960—)，女，教授，博士，主要从事现代分离技术在药学、临床、环境的应用研究。E-mail：zhaoyany606@tom.com