聚合酶链反应对酶联免疫吸附试验HBsAg阴性样本中病毒核酸的检测

房景霞 刘宇思 孙绍秋 李玉梅 房辉

乙型肝炎是HBV感染引起的全球性疾病，而我国是乙型肝炎的高度流行区。据调查统计，在我国人群(＞3岁)中HB-sAg携带率为9.09%，HBV流行率高达60%以上［1］。发病例数约为50万［2］，乙型肝炎的主要传播途径是临床输血传播，我国各级采供血机构对乙型肝炎的筛查检测为酶联免疫检测，但由于酶联免疫吸附法(ELLSA)检测“窗口期”的问题，标本检测漏检在所难免。我站自2008年9月至2009年1月，对无偿献血者血液样本HBsAg ELISA检测阴性的合格样本(共计26 109份)行PCR检测，对PCR检测HBV DNA阳性的血液做报废处理，并对这种献血者跟踪验证，每两周采血做HBV两对半免疫检测。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择我站无偿献血者HBsAg ELISA检查合格血液标本(共计26 109份)，分离血浆备用。DP1000核酸提取仪(上海科华实验系统有限公司)，ABI7300荧光PCR扩增仪(上海科华)。试剂乙型肝炎荧光PCR试剂盒(上海科华生物有限公司，批号:20080328)。

1.2 方法

1.2.1 核酸筛查的样本准备和汇集:采用Pooling-8方式，分别取所选定的8份血浆各150μl至1.5 ml离心管中振荡混匀，加入40μl浓缩剂，再加入50μl促沉剂，混匀后4℃离心1 h(26 000 r/min)，弃去离心管内上层液体，剩余约160μl标本，振荡混匀，低速离心数秒后用于核酸提取。

1.2.2 核酸提取:从每个离心管中吸取100μl待测汇集标本，加入去抑制剂磁珠混合溶液20μl，再加入130μl裂解液，采用核酸提取仪，根据仪器提示，依次加入洗涤液A、B、C及洗脱液，分离提取HBV DNA模板。

1.2.3 PCR扩增检测:在装有已配制好的PCR反应液的反应管中分别加入15μl已处理好的标本。然后将PCR反应管放入ABI7300荧光PCR扩增仪进行扩增检测。PCR反应程序:通过预变性:95℃，2 min;变性:95℃，10 s;退火:55℃，20 s;延伸:72℃，20 s循环检测。

1.3 结果判定 测定CT值≥50，并且内标CT＜45的标本为阴性标本，测定CT值在40～50的标本为灰区标本，建议复测或随访，测定CT值＜40的标本为HBV DNA阳性标本，须进行拆分。

1.4 阳性混合样本的拆分 混合样本阳性者均应进行拆分，找到各个样本并分别进行单独的核酸检测，以确定阳性样本的真正来源。并对HBV DNA阳性献血者血液做报废处理。

1.5 随访 所有HBsAg阴性，HBV DNA阳性的样本都进行随访，并做HBV两对半免疫检测，再次采血应用不同于二次筛查的试剂进行HBsAg ELISA检测，以便查找ELISA检测与核酸检测结果不一致的原因。

2 结果

2.1 PCR筛查结果 26 109份HBsAg阴性无偿献血标本，PCR检测结果为阴性26 107份，阳性2份，ELISA漏检率为7/10万。

2.2 对2份PCR阳性献血者血样做HBV两对半免疫检测结果 见表1。

表1 2份PCR阳性标本乙肝两对半检测结果

2.3 2名PCR阳性献血者追踪随访结果 见表2。

表2 2名PCR阳性献血者HBsAg追踪随访结果

3 讨论

HBV隐匿性感染常见于血清中仅有抗-HBc阳性的人群，表现为HBsAg表达水平低或不表达，而在血清或肝组织中能检测到的HBV DNA，也多为病毒滴度很低。参照文献［3］本次实验结果26 109份HBsAg阴性的合格样本中共检出HBV DNA阳性血样2例，检出率为7/10万。对该2名献血者进行乙肝两对半追踪检测，其中一名献血者抗-HBc阳性，另一名献血者检测为阴性，后进行2～12周HBsAg检测，1名献血者转阳，另1名虽然未转阳，却并不能排除HBV感染，可能是因为HBsAg的表达水平低于检测的最低限度。可见血清学检测HBsAg阴性并不能完全排除HBV感染。基于目前检测HBsAg的ELISA试剂灵敏度不够，难以检出HBsAg呈低水平的人群的这种状况，人们开始探讨使用核酸检测技术，核酸检测技术可以显著缩短血液感染病毒的检测“窗口期”，降低经输血途径传播病毒的风险。能提前20 d筛查出HBsAg阴性、HBV DNA阳性献血者，因此核酸检测技术比ELISA更灵敏，尽管从理论上并不能完全排除“窗口期”，但病毒核酸转阳前的传染性很低［4］，因此将核酸检测技术用于血液筛查对提高输血安全有着重要的意义。但PCR只能检出复制状态的病毒，难以表达非复制状态的感染，因而用PCR方法检测HBV DNA也不能完全代替血清标志物的检测。

要加强对献血者的筛选，首先应用ELISA法检测HBsAg，去除HBsAg阳性血液，然后在此基础上建议对HBsAg阴性血液加做PCR对HBV DNA核酸检测，去除HBV DNA阳性血液，以确保输血的安全。

1 梁晓峰，陈园生，王晓军.中国3岁以上人群乙型肝炎血清流行病学研究.中华流行病学杂志，2005，26:655-658.

2 王憬惺.乙型肝炎和输血.中国输血杂志，2006，19(增刊):16-18.

3 王良华，叶贤林，尚桂芳，等.免疫筛查阴性献血者血样病毒核酸检测的研究.中国输血杂志，2005，18:286-289.

4 季阳主编.输血相关乙型肝炎及丙型肝炎的实验室诊断.输血与输血技术.第1版.北京:人民卫生出版社，2003.218-220.