CXCR4、HPA在非小细胞肺癌组织中的表达及意义

姚继方 王明正 王朋

肿瘤转移是由诸多因素决定的多步骤、序贯性的生物学过程，它涉及肿瘤细胞的运动、迁移、粘附、侵袭、生长、新血管生成、逃避免疫等几个关键步骤，但具体机制仍不清楚。非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌80%以上，很多患者就诊时已经发生了远处转移，转移是影响NSCLC患者5年生存率的重要因素，也是导致患者死亡的重要原因。近年来，趋化因子及其受体所介导的肿瘤转移“归巢”信号机制的提出，丰富和发展了Paget的“种子与土壤”学说，研究发现，趋化因子及其受体所介导的肿瘤特异性器官转移主要是通过基质细胞衍生因子(SDF-1)/趋化因子受体-4(CXCR4)通路实现的［1，2］。乙酰肝素酶(HPA)是体内唯一可以水解细胞外基质和基底膜中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖的内切酶，研究发现HPA活性增强与多种肿瘤转移有关［3，4］。本研究采用免疫组化的方法，通过对NSCLC手术切除标本检测CXCR4、HPA的表达，并与正常肺组织进行对比，结合患者临床病理资料，探讨CXCR4、HPA在NSCLC中发生发展的关系，为判断NSCLC的生物学行为提供参考指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2009年3至12月在河北医科大学第四医院胸外科行手术切除的NSCLC组织标本52例，同时取20例正常肺组织(距离肿瘤边缘5 cm以上)标本作为对照。所有标本经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片，HE染色后经病理学检查证实。所有病例均无术前化疗、放疗治疗史。其中男42例，女10例;年龄40～74岁，平均年龄62.40岁;鳞癌22例，腺癌17例，腺棘细胞癌10例，粘液表皮样癌2例，透明细胞癌1例;无淋巴结转移26例，淋巴结转移26例;临床分期采用国际抗癌协会(UICC)2009年公布的NSCLC TNM分类分期标准:Ⅰ与Ⅱ期29例，Ⅲ与Ⅳ期23例。

1.2 试剂与方法 兔抗人CXCR4单克隆抗体购自Abcam(Hong Kong)公司，兔抗人HPA单克隆抗体购自SANT CRUZ生物技术公司，即用型Biotin SP-HRP免疫组化染色试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，浓缩型DAB试剂盒购自中国中杉金桥试剂公司。采用免疫组织化学S-P法，按试剂盒说明书进行操作。

1.3 结果判定 CXCR4、HPA阳性染色定位于细胞浆，以胞浆内出现均匀一致的棕黄色颗粒定义为阳性细胞。参照Andre等［5］评分标准，随即选取5个高倍视野(×400)计数肿瘤细胞总数和阳性细胞数，得出阳性细胞百分率，采用半定量的方法进行，根据免疫组化染色阳性肿瘤的比例和染色强度进行评分:无阳性细胞0分，＜10%1分，10% ～50%2分，＞50%3分;无着色0分，轻度着色(浅黄色)1分，中度着色(棕黄色)2分，重度着色(棕褐色)3分。将上述两项得分相加:＜3分为阴性(－)，≥3分为阳性(+)。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计数资料采用χ2检验，两变量之间的分析采用Spearman等级相关分析，采用双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC组织和正常肺组织中 CXCR4的表达 52例NSCLC组织中CXCR4阳性表达率为63.46%(33/52)，20例正常肺组织中CXCR4阳性表达率为15%(3/20)，前者明显高于后者，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1。在NSCLC组织中，CXCR4与患者性别、年龄、肿瘤组织学类型、分化程度无关(P＞0.05)，而与淋巴结转移、肿瘤 TNM分期有关(P＜0.05)，有淋巴结转移组CXCR4表达明显高于无淋巴结转移组(P＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ组CXCR4表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期组(P ＜0.05)。见表 2。

表1 CXCR4，HPA在正常肺组织和NSCLC组织中的表达例(%)

2.2 NSCLC组织和正常肺组织中HPA的表达 52例NSCLC组织中HPA阳性表达率为55.77%(29/52)，20例正常肺组织中HPA阳性表达率为10%(2/20)，前者明显高于后者，有统计学意义(P＜0.01)。见表1。在NSCLC组织中，HPA与患者性别、年龄、肿瘤组织学类型、肿瘤分化程度无关(P＞0.05)，而与淋巴结转移、肿瘤TNM分期有关(P＜0.05)，即有淋巴结转移组HPA表达明显高于无淋巴结转移组(χ2=9.433，P＜0.01)，Ⅲ、Ⅳ组 HPA 表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期组(χ2=5.504，P＜0.05)。见表2。

表2 CXCR4，HPA在NSCLC组织的表达与临床病理特征的相关性例

2.3 用Spearman等级相关分析CXCR4、HPA两者之间表达的相关性 CXCR4、HPA在NSCLC组织中的表达经Spearman等级相关分析，两者表达呈显著正相关(r=0.289，P=0.038)。见表3。

图2 HPA在NSCLC组织中的表达(SP×400)

图1 CXCR4 NSCLC组织中的表达(SP×200)

表3 CXCR4与HPA两表之间表达的相关性 例

3 讨论

近年来肺癌的发病率不断上升，每年约有110万人死于肺癌［6］。复发和转移是导致患者死亡的重要原因，也是影响患者5年生存率的重要因素，肿瘤转移是一个非随机的、高度组织器官选择性的生物学过程，近年来研究发现趋化因子及其受体在肿瘤器官特异性转移中发挥重要作用［7］。Muller等［8］报道，乳腺癌细胞系、乳腺癌原发灶及转移灶高表达CXCR4，在乳腺癌最常见的转移部位高水平地表达其配体SDF-1，CXCR4与SDF-1结合可引起乳腺癌细胞内骨架蛋白的聚合与再分布，调节细胞的运动和迁移。Ottaiano等［9］对结直肠组织的研究发现，CXCR4的表达在正常黏膜、结肠息肉组织、结直肠癌组织中呈逐渐上升趋势，并且结直肠癌组织及结直肠癌伴肝转移者CXCR4的表达均为高表达，结直肠癌及发生肝转移的结直肠癌CXCR4表达显著高于正常组织。到目前为止，已经发现CXCR4至少在23种不同类型肿瘤中均有表达，是肿瘤细胞表达最为普遍的趋化因子受体，并且和患者的预后相关［10］，研究者推测高表达CXCR4的肿瘤细胞，可能在SDF-1趋化、牵引下，逆浓度梯度转移至作为配体产生源的某些器官，从而形成器官特异性转移［11，12］。

肿瘤细胞要实现侵袭和转移，必须穿过由细胞外基质和基底膜构成的屏障。糖氨聚糖是基底膜与细胞外基质的重要组成部分，其主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)，HPA是一种可以特异性降解HSPG中糖链的内切酶，近年来研究发现HPA过表达与肿瘤的转移潜能具有相关性，并可能影响患者的预后。Han等［13］用免疫组织化学的方法发现79例食管癌切除标本中有52例HPA表达阳性，肿瘤组织中HPA的表达比癌旁组织和正常组织中明显增高，并且与肿瘤的浸润深度、临床分期和淋巴结转移呈正相关。Vlodavsky等［14］检测了不同转移潜能肿瘤细胞中HPA的活性，发现高转移潜能肿瘤细胞中HPA活性比低转移潜能肿瘤细胞中高4～10倍，将HPAcDNA导入无转移潜力的鼠淋巴瘤细胞及低转移潜力的黑色素瘤，这些细胞获得了高转移潜能。Parish等［15］采用乙酰肝素酶抑制剂后，淋巴结转移率降低约40%，肿瘤周围血管减少了30%，证实了HPA具有促进新生血管生成、促进肿瘤细胞转移的作用。

苏丽萍等［16］研究认为肺癌的侵袭转移在某种程度上是由于XCR4、SDF-1的相互作用导致，CXCR4、SDF-1的相互作用可以触发与肿瘤转移有关的多个事件的发生，如肿瘤细胞的侵袭能力、肿瘤细胞的运动能力、与血管内皮的黏附能力等。HPA可以裂解连接于细胞外基质和基底膜的重要组成成分，破坏其完整性，促进肿瘤细胞的侵袭和转移，因此我们推测CXCR4与HPA之间可能存在相关性，为此我们检测了NSCLC组织中CXCR4、HPA的表达，发现NSCLC组织中CXCR4、HPA的表达与正常肺组织相比，NSCLC组织中高水平表达CXCR4、HPA，为了进一步探讨CXCR4、HPA在NSCLC组织中高表达的临床意义，我们分析了CXCR4、HPA在NSCLC组织中的表达和患者临床特征之间的关系，初步研究结果显示CXCR4、HPA的表达与患者的年龄、性别、肿瘤分化程度、组织学类型无明显关联，而与淋巴结转移、TNM分期相关，CXCR4阳性表达与HPA阳性表达呈正相关，提示CXCR4与HPA可能共同参与NSCLC的侵袭和转移过程。

综上所述，CXCR4、HPA在NSCLC组织中高表达，提示两者可能共同参与NSCLC的侵袭和转移，联合检测CXCR4、HPA有助于判断NSCLC的转移潜能和患者的预后，可能为NSCLC的治疗提供新的分子靶点和策略。

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16 苏丽萍，张进平，徐焕宾，等.CXCR4在肺癌转移中的作用及其机制研究.中华医学杂志，2005，85:1190-1194.