Fascin、β-catenin、E-cadherin 在大肠腺瘤癌变过程中的表达及意义

宋晓昕

结肠癌是一种常见的恶性肿瘤，我国结肠癌发病率和死亡率有逐年增加的趋势。侵袭和转移是导致结肠癌患者临床治疗失败和死亡的主要原因之一。目前认为肿瘤转移是一种主动过程，需要肿瘤细胞运动，从原发灶脱离，穿破结缔组织构成的基底膜及血管淋巴管壁的机械屏障，进入体液循环，最后再次穿透血管淋巴管壁在靶器官定位，并在该处扩增成转移灶，可基本概括为癌组织在浸润转移前进行细胞自身的粘附解除;癌细胞粘附于基质;癌细胞释放蛋白水解酶降解基质(ECM);癌细胞的移行等。Liotta等［1］将此概括为肿瘤细胞浸润转移的3步假说，即粘附、降解和移动。虽然肿瘤的侵袭转移是多基因参与、多步骤完成的复杂过程，但是肿瘤细胞间粘附减弱和肿瘤细胞运动能力增强无疑是肿瘤发生侵袭转移的基础。本研究应用免疫组织化学技术检测Fascin、β-连接素(βcatenin)、上皮钙黏附素(E-cadherin)蛋白在正常大肠黏膜、大肠腺瘤、大肠腺瘤恶变和大肠癌中的表达及其关系，以探讨Fascin、β-连接素(β-catenin)、上皮钙黏附素(E-cadherin)在大肠癌发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本采集:50例大肠腺瘤取自2003年1月至2008年12月我院内镜活检标本，其中轻度异型增生19例，中、重度异型增生31例。大肠腺瘤癌变病例30例及大肠癌40例取自同期我院手术切除标本作为研究对象，同时以大肠黏膜20例作为对照(均取肠癌标本距肿物10 cm以上的大肠黏膜)。本组研究病例中，男63例，女57例;年龄22～81岁，平均年龄56.1岁;55岁以下43例，55岁以上77例。40例大肠癌中，浸润深度未侵及浆膜13例，侵及浆膜27例;无淋巴结转移24例，有淋巴结转移16例;Dukes分期A+B期24例，C+D期16例，高-中分化29例，低-未分化11例。所有病例全部切片均由两位高年资病理医师严格按照2000年WHO标准［2］进行明确诊断复核。所有标本均经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片。

1.1.2 试剂:鼠抗人 Fascin、E-cadherin、β-catenin 单克隆抗体，通用型SP检测试剂盒和DAB酶底物显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 方法 免疫组织化学按免疫组织化学增强型试剂盒说明书进行，每批染色均设阴、阳性对照，即以PBS替代一抗作为阴性试剂对照，以试剂说明书中推荐的组织切片为阳性组织对照。最佳一抗稀释度的标准是能得到最大的抗原染色强度和最低的背景染色。免疫组化标记采用SP法，抗原修复采用柠檬酸盐缓冲液中加热，保持92～98℃ 15 min，室温下自然冷却。DAB显色。

1.3 染色结果判断 Fascin蛋白阳性产物主要定位于细胞浆，表现为胞浆内有棕黄色颗粒。在间质中高表达，因此，在间质中的表达可以作为内对照。免疫组织化学染色结果采用以下判断标准［3］。将染色程度评分:无色记0分、淡黄色记1分、棕黄色记2分和棕褐色记3分;再将阳性细胞所占的百分比评分:0分为阴性、阳性细胞数≤10%记1分、11% ～50%记2分、51%～75%记3分、＞75%记4分，然后计算两者的乘积。乘积＜3分为阴性，≥3分为阳性。E-cadherin、β-catenin主要表达于正常黏膜上皮的细胞膜上，在相邻的细胞间隙呈连续点状或同质线状分布，以细胞膜为阳性表达部位作为阳性对照。β-catenin染色结果判断标准按照Maruyama等［4］方法，细胞膜阳性表达＞70%为正常表达;细胞膜阳性表达＜70%为表达缺失;细胞质或细胞核＞10%阳性为胞质或胞核阳性表达;胞质或胞核表达称为异位表达;细胞膜表达缺失、胞质或胞核表达统称为表达异常。E-cadherin染色结果以癌细胞细胞膜阳性表达＞70%为正常表达，＜70%为表达缺失。

1.4 统计学分析 应用SPSS13.0统计软件，计数资料采用用χ2检验，Fisher确切概率计算法及相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三种蛋白在不同大肠组织中的表达 fascin蛋白标记定位在癌细胞的胞质中，呈棕黄色颗粒状，β-catenin、E-cadherin正常表达定位于上皮细胞膜，大肠腺瘤、大肠腺瘤恶变和大肠癌组织β-catenin、E-cadherin胞膜表达不同程度缺失，β-catenin呈胞浆和(或)胞核异位表达。正常大肠黏膜组织、大肠腺瘤、大肠腺瘤恶变、大肠癌组织中fascin、β-catenin、E-cadherin的表达情况。见表1。

表1 fascin、β-catenin、E-cadherin蛋白在不同大肠组织中的表达例(%)

2.2 fascin、β-catenin、E-cadherin蛋白表达与大肠癌临床病理参数的关系 见表2。

表2 Fascin、β-catenin、E-cadherin 蛋白表达与大肠癌中临床病理因素的相关性 例(%)

2.3 fascin、β-catenin、E-cadherin蛋白在大肠癌中表达的相关性 Fascin阳性表达与β-catenin异位表达呈正相关(r=0.711，P ＜0.01);Fascin阳性表达与E-cadherin膜表达呈负相关(r= －0.803，P ＜0.01);β-catenin膜表达 E-cadherin膜表达呈正相关(r=0.849，P ＜0.01)。见表 3。

表3 大肠癌中Fascin、β-catenin、E-cadherin 蛋白表达的相关性例

3 讨论

侵袭、转移行为是恶性肿瘤的本质特性。肿瘤细胞迁移和侵袭的起始步骤是细胞向迁移的方向伸出突起［5］。研究发现细胞的运动是由actin的组装状态所驱动的，细胞通过组装actin纤维分支网络而形成运动前缘的细胞突起［6］。人类fascin-1基因属于fascin家族，其基因编码产物是一种细胞骨架蛋白，可与F-actin结合，又称为actin束蛋白，定位于细胞质应力纤维 (stressfibers)、细胞膜皱褶 (membraneruffies)边缘的丝状伪足(filopodia)、微刺(mierospikes)的核心actin束中，在细胞迁移时集中于细胞前缘的突起［7］。Fascin蛋白在正常上皮细胞中不表达或低表达，但在一些上皮组织肿瘤中常表达上调。fascin的过度表达可导致细胞间粘着力降低和细胞运动活性增加。

E-cadherin/β-catenin复合体是介导同型细胞间粘附的连接复合体，其在维持正常上皮的极性和完整性中起重要作用，肿瘤细胞间粘附的丧失是肿瘤侵袭、转移的关键。

Catenins是第一个具有连接细胞-细胞黏附分子cadherin的细胞质区至actin骨架蛋白特征的分子，它的基本作用是调整cadherin的黏附性。而fascin将actin细丝束缚至β-catenin的中央Armadillo重复区，fascin and E-cadherin与β-catenin结合利用相似的结合位点，形成互助的复合体。fascin and E-cadherin局限于细胞-细胞边缘及动态细胞如上皮和内皮细胞的前沿。β-catenin可能参与fascin联合调整细胞骨架动力学［8］。

本研究结果表明Fascin/E-cadherin、β-catenin蛋白在大肠黏膜—腺瘤—腺瘤癌变—癌序列中的胞浆/胞膜阳性表达呈逐步增强/减弱趋势，β-catenin异位表达逐步增强。Fascin/E-cadherin、β-catenin在结直肠癌组织中的阳性表达明显高于/低于正常黏膜及腺瘤组织中的表达(P＜0.05);Fascin阳性表达与β-catenin异位表达呈正相关(r=0.711，P ＜0.01)，Fascin 阳性表达与 E-cadherin膜表达呈负相关(r=－0.803，P ＜0.01)，β-catenin膜表达 E-cadherin膜表达呈正相关(r=0.849，P ＜0.01)。本研究对 fascin、E-cadherin、β-catenin 蛋白在结、直肠癌组织中表达的临床病理意义进行比较分析，结果表明，随淋巴结转移的发生、肿瘤侵润深度不断增加，组织学分级的增高及临床分期的进展，fascin/E-cadherin、β-catenin蛋白的阳性表达率均明显增高/减低(P＜0.05)。而与患者的年龄、性别无关(P＞0.05)。提示Fascin阳性表达的肿瘤往往有较高的组织学分级或者较高的侵袭性。E-cadherin/β-catenin复合体黏附特性的改变也可能导致细胞骨架的重排。从而促进肿瘤的浸润转移。

研究发现，正常胆管上皮细胞不表达fascin而在癌细胞中经常有阳性表达［9］。侵袭性肿瘤细胞大量地表达fascin，在肿瘤侵袭的前沿较其他区域更为常见。并且还发现增强fascin的免疫反应性有干扰E-cadherin和β-catenin的膜的免疫反应性。在fascin过表达的肿瘤细胞中E-cadherin和betacatenin在膜上的表达减低。还有研究者认为在结直肠癌中fascin表达可能受wnt途径的调节［4］，导致fascin蛋白的异常表达，提高了细胞运动能力和移动性，促使细胞产生各种恶性行为。而最近对结肠癌的研究中发现，fascin是β-catenin-TCF信号通路的新靶点之一。Fascin、β-catenin、E-cadherin联合应用有可能作为一种判断预后的指标，从而早期识别那些具有高度侵袭和转移潜能的肿瘤。而且fascin也很有可能成为一个新的基因治疗靶点。

1 Liotta LA，Mandler R，Murano G，et al.Tumor cell autocrine motiling factor.Proc Natl Acid Sci USA，1986，83:3302-3306.

2 WHO.肿瘤国际组织学新分类-肠道肿瘤组织学分型.诊断病理学杂志社，2000.12.

3 许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准.中国癌症杂志，1996，6:229-231.

4 Maruyama K，Ochiai A，Akimoto S，et al.Cyoplasmic beta-catenin Accumulation as a Predictor of hematogenous metastamis in human coldrectal.Caneer.Oncology，2000，59:302-309.

5 Friedl P，Wolf K.Tumour-cell invasion and migration:diversity and escap mechanisms.Nat Rev Cancer，2003，3:362-372.

6 Pollard TD，Borisy GG.Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.Cell，2003，112:453-65.

7 Yamashiro-Matsumura S，Matsumura F.Intracellular localization of the 55-kD Actin-bundling Protein in cultured cells:spatial relationships with actin，alpha-actinin，tropomyosin，and fimbrin.J Cell Biol，1986，103:631-640.

8 Tao YS，Edwards RA，Tubb B，et al.Beta-catenin associates with the actin-bundling protein fascin in a noncadherin complex.J Cell Biol，1996，134:1271-1281.

9 Okada K，Shimura T，Asakawa K，et al.Fascin expression is correlated with tumor progression of extrahepatic bile duct cancer.Hepatogastroenterology，2007，54:17-21.