庆大霉素产生菌的基因工程育种

邱小明，刘志琼



庆大霉素产生菌的基因工程育种

邱小明1，刘志琼2

（1.漳州职业技术学院 食品与生物工程系，福建 漳州 363000；2.上海皑博生物科技有限公司，上海 201620）

研究小单孢菌产抗生素的生物合成机理，利用基因克隆方法从棘孢小单孢菌（）中克隆出产庆大霉素生物合成的关键酶基因—2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因（gntB），并将其通过大肠杆菌――链霉菌穿梭质粒pIJ699转化原菌株，采用硫链丝菌素抗性基因启动子带动2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因表达,在培养条件不变的情况下重组菌产抗率较原菌株提高3.5％。

棘孢小单孢菌；2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因；产素率；pIJ699；表达CLC Q78

氨基糖苷类抗生素是重要的抗感染药物，而小单孢菌是氨基糖苷类抗生素的重要产生菌，如产庆大霉素的棘孢小单孢菌和绛红色小单孢菌；产西索米星的伊尼奥小单孢菌等。多年来，人们采用传统的育种手段来改造小单孢菌的生物合成,但是收效甚微。几种小单孢菌合成抗生素的水平(如庆大霉素,西索米星等)远远低于由链霉菌所产的抗生素(如链霉素和四环素等)[1]。

而基因工程育种可以按照人们事先设计和控制的方法进行育种，是一种最新、最先进的育种技术。随着人们对抗生素生物合成基因以及调控基因的深入了解,人们可以在分子水平上改造微生物使它们过量合成抗生素。通过提高限速步骤酶活力或过量合成限速步骤酶[2]或增加其自身对抗生素抗性[3]的方法来提高微生物合成抗生素的产量。

近年来,随着分子生物学的发展,很多临床上重要的抗生素的生物合成基因已被确定,例如β-内酰胺类抗生素(青霉素类、头孢菌素类)、多肽类抗生素(短杆菌肽等) 、多聚酮类抗生素(大环内酯类、四环类)。虽然对临床上应用非常广泛的氨基糖苷类抗生素的生物合成基因研究还较少,但几种小单孢菌产生抗生素的生物合成基因簇已被确定，如棘孢小单孢菌和绛红色小单孢菌生物合成庆大霉素的基因簇[4-6]等，同时确定2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因（gntB）是合成庆大霉素基因簇中的一个关键酶基因[7]。

本实验从棘孢小单孢菌基因组中扩增出gntB基因，尝试用链霉菌表达性质粒pIJ699转化原菌株（棘孢小单孢菌），使gntB得到过量表达，以期提高棘孢小单孢菌产庆大霉素的水平。

1 材料和方法

1.1 菌株和质粒

棘孢小单孢菌菌株由福建师范大学赠送；DH5α、质粒pBS－T购自天根公司；质粒pIJ699由上海医药工业研究院陈代杰教授馈赠。

1.2 工具酶及试剂

实验所需限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、4种dNTP Mixture等均为NEB公司产品，DNA凝胶回收试剂盒为杭州博日公司产品，溶菌酶、蛋白酶K、RNase为上海生工产品，DNA标样为TaKaRa公司产品。

1.3 抗生素：氨苄青霉素（Amp）、硫链丝菌素（Tsr）、新霉素（Neo）购自华美公司。

1.4 培养基及培养方法

LB(Luria-Bertain)培养基：Trypton 1.0％、Yeast Extract 0.5 ％、NaCl 1.0％，pH 7.4，121℃高压灭菌 20min。若为固体培养基，则另外加入1.7％的琼脂。根据需要添加氨苄青霉素(终浓度50～100μg/ml)和新霉素(终浓度50μg/ml)。

棘孢小单孢菌种子摇瓶培养基（g/L）：黄豆饼粉 20，玉米粉25，蛋白胨 5，KNO30.5，CaCO34，葡萄糖1，pH 7.2，35℃，220r/min,培养 36h左右。

棘孢小单孢菌发酵培养基（g/L）：可溶性淀粉 20 ,黄豆饼粉 20 ,蛋白胨 5，葡萄糖5, CaCO34, MnSO4. 0.0001, CoCl20.001, pH 7.8。35℃，220r/min ,培养 120h。

棘孢小单孢菌原生质体制备培养基（g/L）：可溶性淀粉 20 ,黄豆饼粉 20 ,蛋白胨 5，葡萄糖5，CaCO34，MnSO4.0.0001，CoCl20.001，Gly 3，pH 7.8，35℃，220r/min培养48h。

棘孢小单孢菌原生质体再生培养基（g/L）：可溶性淀粉 40，蔗糖：103，MgCl210, KNO31, K2HPO40.3, MgSO40.5, NaCl 0.5, CaCO31,天冬素0.02，麸皮30，琼脂15，pH 7.6～7.8，35℃培养10天左右。

1.5 缓冲液

P缓冲液、转化缓冲液的配制[8-9]。

1.6 操作方法

1.6.1DNA的操作方法[10-11]

主要有染色体DNA的提取与纯化、质粒DNA的提取与纯化、DNA的酶切、连接、转化等操作。

1.6.2原生质体的制备[8-9]

2 结果

2.1 引物的设计及gntB的克隆

从Genbank中查出棘孢小单孢菌产庆大霉素生物合成基因簇中2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因（gntB）作为引物设计的参考模板(AY524043)，设计、合成一对简并引物。

上游引物P1为：CCATGGAGGT CGAGATACGCC ()；

下游引物P2为：CGTCAACCAT CGGCAGCACC ()。

上、下游引物各包含了一个酶切位点，引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。

2.2 GntB基因的克隆

表1 PCR反应体系

抽提棘孢小单孢菌的染色体DNA作为模板，按表1将各成分在无菌的200μl eppendorf管中混合，装样量为30μl，在PCR自动扩增仪中进行扩增。PCR运行循环条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃复性1min，72℃延伸2min，循环30次，最后72℃保温10min。

按照上述反应条件在PCR仪中扩增gntB，再用浓度为0.8％的琼脂糖凝胶走电泳，结果如图1。经测序,确定扩增片断是2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因。

图1 从棘孢小单孢菌基因组中扩增gntB基因的电泳图

M:1kb DNA Marker;

1～5:gntB基因PCR产物

图2 重组质粒pBS-T-gntB 酶切鉴定电泳图

M:1kb DNA Marker1:pBS-T-gntB重组质粒；

2～3:pBS-T-gntB质粒酶切（）

2.3 含gntB基因的大肠杆菌――链霉菌穿梭质粒的构建

2.3.1 pIJ699

目前小单孢菌的克隆系统缺少合适的载体，而链霉菌属含有大量的野生型质粒，其中pIJ699是大肠杆菌/ 链霉菌穿梭质粒,它是一个含有pIJ101型链霉菌复制子和p15A型大肠杆菌复制子的正选择穿梭载体质粒，它是一种提供正选择的质粒载体,同时含有用于链霉菌转化系统的筛选标记硫链丝菌素抗性基因以及用于大肠杆菌转化系统的筛选标记紫霉素抗性基因（）和新霉素抗性基因（）。它被和双酶切后产生一条5kb片段,是含有链霉菌复制子,两端为回文序列的线性化载体片段,当含有链霉菌复制子载体片段与外源DNA 片段连接后重组时,质粒才能正常复制并使宿主菌产生抗性,而自身环化的载体由于两回文序列没被隔开而无法复制,所以转化子均携带有外源DNA片段[12]。所以我们尝试用pIJ699来携带gntB转化棘孢小单孢菌原生质体。

2.3.2 pIJ699－gntB重组质粒的构建

将gntB基因与载体pBS－T连接,构建pBS-T-gntB重组质粒,然后转化DH5α感受态细胞,培养、筛选重组菌,抽提、鉴定重组质粒，再用内切酶酶切，电泳，结果如图2所示，回收1193bp片断。

同时将质粒pIJ699 转化DH5α感受态细胞，使其得到扩增，再用内切酶和双酶切，回收5kb（）片断。并将其与上述回收的gntB基因（）连接，得到pIJ699－gntB重组质粒。具体过程如图3所示。

2.4 PEG介导的原生质体转化以及重组菌的筛选

取12.5μl新鲜制备的棘孢小单孢菌原生质体悬液（1～5 ×1010个/ml）、10μl质粒DNA溶液和40μl P缓冲液，依次加入到一无菌的1.5ml Eppendorf管中,室温静置1min，然后加入含有25 %（vol/vol）PEG1000的转化缓冲液，吹吸混匀,30℃水浴加热30分钟。反应结束加入200μl P缓冲液稀释，再3500rpm离心10分钟,弃部分上清,取100μl涂布于原生质体再生培养基（平板表面无冷凝水，双层：下层为再生培养基，上层为5ml含有25μg/ml硫链丝菌素的再生培养基），35℃培养10天后检测转化子（由于可能存在的质粒不相容性，所以我们选择去除内源性质粒的棘孢小单孢菌作为转化对象）。

经过10天左右的培养，从原生质体再生平板上挑选转化子，并进行培养、抽提质粒、酶切、电泳鉴定，电泳结果如图3所示。

从图4 可以看出pIJ699－gntB被成功地转化到去除内源性质粒的棘孢小单孢菌中去。

图3 重组质粒pIJ699－gntB的构建

图4 重组质粒 pIJ699-gntB 的酶切产物电泳图

M:1kb DNA Marker; 1：酶切pIJ699-gntB重组质粒 2：重组质粒 pIJ699-gntB

2.5 重组菌发酵,效价测定

将获得的转化了pIJ699-gntB的重组菌挑选单菌落接入到棘孢小单孢菌的斜面培养基上,35℃培养7天.再挖块接入种子摇瓶中,培养36～48h（待种液颜色变为微红）后转接到发酵培养基中 (共10瓶)，35℃，220rpm/min培养120h，酸化、过滤，测定庆大霉素效价,数据如表2所示(同时在相同条件下做10瓶去除质粒的原始菌株发酵摇瓶作为对照)。从表2得出棘孢小单孢菌重组菌的发酵效价较原始菌株提高了3.5％。

表2 棘孢小单孢菌重组菌与原菌株发酵效价的比较

3 讨论

由于标准曲线的制定、发酵液效价的测定等都存在一定的误差，重组菌发酵效价较原菌株提高 3.5％也在这个误差范围之内，所以不能确定gntB在重组菌中是否得到了表达。可能存在如下几种可能：

（1）外源gntB基因得到了表达

在重组菌中外源基因gntB得到了表达，但是表达的效率不高，致使庆大霉素的产素能力没有得到较大幅度提高。

重组菌的表达受很多因素的影响，如温度、供氧量、诱导剂等，在大肠杆菌中表达外源基因经常用低温和加入IPTG等诱导剂的方法诱导其表达，在重组酵母中也经常用甲醇来诱导外源基因表达，但由于在小单孢菌中表达外源基因目前尚无报道，也没有关于2-脱氧青蟹肌糖合成酶酶活测定方法方面的报道，因此无法选择合适的诱导剂诱导表达或通过测定重组菌2-脱氧青蟹肌糖合成酶酶活来直接判断gntB基因是否得到了表达。

（2）外源基因gntB没有得到表达

在重组菌中外源重组质粒pIJ699－gntB也可能没有得到表达，因为pIJ699是链霉菌－大肠杆菌的穿梭质粒，可能在小单孢菌中无法使携带的外源基因gntB得到表达。

（3）部分重组菌可能发生质粒丢失情况

为了提高重组菌培养时质粒的稳定性，首先将其接到种子培养基中生长成菌丝，再转接到含25μg/ml硫链丝菌素的发酵培养基中，诱导外源基因表达，测定发酵液产素水平，发现没有多大变化。

因此推断可能是重组质粒pIJ699－gntB在目前的培养条件下没有得到充分表达，或者是外源基因gntB通过链霉菌表达载体pIJ699在棘孢小单孢菌中不能表达所致。但本工作已进行了尝试，为今后的小单孢菌的基因重组积累了经验，奠定了基础。

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Genetic engineering breeding of Gentamicin producing trains

QIU Xiao-ming1，LIU Zhi-qiong2

（1.Foods and biology engineering department, Zhangzhou Institute of Technology, Fujian Zhangzhou 363000,China; 2.Shanghai Kaibo Biotechnology limited Co., Shanghai 201620,China）

The biosynthetic mechanism of producing antibiotic by some members of the actinomycete genus micromonospora was studied.Using the gene-cloning method to clone the key enzyme gene of gentamicin biosynthesis （gntB）from micromonospora echinospora through a E. coli－Streptomyces shuttle plasmid pIJ699. One clone harboring a plasmid that contains gntB was obtained from selectivity culture medium. Exterior gntB was driven by Promoter of Thiostrepton resistance gene in Micromonospora echinospora. The rate of gentamicin production was enhanced by 3.5% under the same cultivating condition.

Micromonospora echinospora；gntB；The rate of production；pij699；expression CLC Q78

2010－07－24

邱小明（1979－），男，助教，硕士，研究方向：生物技术与生化反应工程。

R764

A

1673-1417（2010）03-0069-05