变色液体培养基用于结核分枝杆菌快速培养的研究

张传兴

（山东省血液中心，山东 济南 250014）

结核病的发病率呈在我国呈上升趋势,对结核病的诊断基层医院承担着重要的工作,目前结核病的实验室诊断主要有细菌学检验、免疫学检验及分子生物学诊断方法,后两种因为方法学还未完善,假阳性和假阴性率较高。结核分枝杆菌的培养分离仍然是诊断结核病的 “金标准",是药物敏感性检测的基础。近年来,变色液体培养基的应用受到越来越多的重视[1],为了评价此种检验方法的优劣并评估其在我们医院的应用情况,我们进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 实验对象

所有患者均经临床表现、实验室检查、X线或CT检查和临床治疗转归证实而确诊为活动性肺结核,其中男108例,女92例,年龄(39±8)岁。

1.2 标本来源

200份痰标本均取自2002年7月至2008年5月在齐鲁医院和千佛山医院的住院和门诊的肺结核病人的新鲜晨痰,为清晨漱口后轻咳,留取肺深部积痰2mL以上,置入无菌管中备检。

1.3 实验方法

每份标本先行涂片检查,然后经2～4倍体积的4%NaOH消化20min,离心10min,用无菌磷酸盐缓冲液洗涤沉淀物,后加入该液400μL混匀,同时严格按操作规程进行BACT/ALERT 3D、L-J培养基培养法和变色液体培养基的检验。

1.4 实验试剂

L-J培养基按《全国临床检验操作规程》配制；快速变色液体培养基由深圳怡百世生物技术有限公司提供商品化试剂盒,其主要成分为:磷酸盐缓冲液、谷氨酸钠、维生素、微量元素、甘油、马血清、变色剂以及多种抗生素,严格按试剂盒操作说明进行操作；BACT/ALERT 3D按照说明书进行操作。

1.5 结果判断

改良罗氏培培养法接种后3 d、7 d和之后每周观察结果,有菌落生长并涂片证实后判为阳性[2],并记录检出时间,两月后无菌落生长判为阴性;快速变色培养基每24h观察结果1次,两周后每3d观察1次,若培养基变为紫红色或有紫红色沉淀,经涂片证实为抗酸杆菌为阳性,记录检出时间,1月后不变色视为阴性。

1.6 统计学方法

采用SPSS12.0软件进行统计分析。

2 结果

快速液体变色培养法与图片法、BACT/ALERT 3D、L-J培养基培养法的比较结果见表1。快速液体变色培养法与涂片法相比阳性率高并且有显著性差异外,高于L-J培养法，低于BACT/ALERT法,但与两者比较均无显著性差异。

对涂片法阳性和阴性的再用快速液体变色培养法培养结果见表2。

表1 200例肺结核患者痰液标本的几种检测率比较

表2 快速液体变色培养法与涂片法的比较

快速液体变色培养法对涂片阳性119例的检出率为91.6%;对涂片法81例阴性的检出率为85.19%。χ2检验有统计学意义。日常工作中，只做涂片，会有误差，两者结合，结果会更可靠。

快速液体变色培养法平均检出时间为5.6 d,改良L-J培养基的平均检出时间为14.9 d,BACT/ ALERT 3D平均时间也是14天，前者时间明显短余后两者，说明快速液体变色培养基更利于结核病的早期诊断。

3 讨论

新的结核分枝杆菌快速培养基及快速培养方法的探索为分枝杆菌的培养分离提供了新的思路,但大多数方法尚未得到大样本标本的检验,没有得到公认,不能取代传统方法。本实验所用的快速液体变色培养基为营养丰富并含抗生素的选择性培养基,通过多种抗生素抑制其他微生物的生长,当有活的分枝杆菌存在时,并将以每繁殖一代15h～20h的速度生长(高于固体培养基中的(20h～24 h)[3],并随生长过程中氧的消耗,对氧敏感的色素物质变为紫红色,从而显示阳性结果。

此方法与涂片法相比阳性率显著较高,也高于L-J培养法,而与涂片法结合使用可使阳性率大大提高。在检测时间上,远远短于L-J培养法,相对更能达到快速诊断的目的。检验过程不需特殊仪器,商品化的试剂盒也避免了繁杂的L-J培养基的配制工作,大大简化了操作过程,提高了效率。BACT/ ALERT BACTEC MGIT 960系统、BACTEC 9000 MB系统、ESPⅡ、MB/BacT等全自动分离培养技术系统具有快速、敏感、高效、无放射性污染等优点，但费用昂贵,污染率较高,尚需进一步改进和完善。

熊礼宽等[1]研究表明,变色液体培养基总阳性率(53.2%)高于L-J培养基(8.3%)[4]。赵锦等[5]研究表明,从细菌生长周期看,变色液体培养基平均生长天数为10d,明显短于L-J培养基(平均为25d)。但变色液体培养基污染率(6.9%)略高于L-J培养基(4%),差异无显著性(0.25＜P＜0.5)。其原因可能与标本前处理及洗涤沉淀中操作程序有关。此外,变色液体培养基结果判断尚有主观性,且变色时间持续较短,仅2～3d紫色即消失,需及时观察结果。因此，该培养基在如何选择稳定性强的指示剂方面尚待进一步探索和改进。该培养基培养阳性率高,检出时间快,污染率低,操作简便、经济、实用、不需特殊仪器设备。具有广泛的临床应用前景。

[1]熊礼宽,杨应用,黄炜.一种新型快速检出分枝杆菌变色液体培养基的评价[J].中华检验医学杂志,2001,24(1):49.

[2]金法祥,汤佳良,祝桂琅.结核分枝杆菌快速培养[J].临床检验杂,2004,2(2):235-236.

[3]熊国亮,张慧慧,雷建平.变色液体培养基快速检测分枝杆菌的临床应用评价[J].江西医学检验,2003,21:69270.

[4]Noordhoek G T,Arend H J.Gunnar B.Sensitivity and specificity ofPCR for detection of Mycobacterium tuberculosis:a blind comparision study among seven laboratories[J].Journals of Clinical Micro2biology,1994,32(3):277-284.

[5]赵锦，徐萍，王强，等，分枝杆菌快速变色液体培养基临床应用的评价[J].中国防痨杂志,2006,28(2):125-126.