缺血性脑血管病患者同型半胱氨酸代谢酶MTRR基因A66G及cystatin C基因G73A多态性检测*

张爱玲,滕军放,赵莘瑜

郑州大学第一附属医院神经内科郑州 450052

#通讯作者,男,1960年11月生,本科,主任医师,研究方向:脑血管病,E-mail:tjf.6666@yahoo.com.cn.

动脉粥样硬化是缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease,ICVD)发生的重要病理生理基础,研究[1-2]表明半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C)作为最主要的内源性组织蛋白酶抑制剂,与同型半胱氨酸(Hcy)、半胱氨酸蛋白酶等相互作用,参与动脉粥样硬化及心脑血管疾病的病理生理过程, cystatin C编码基因CST3及Hcy代谢酶蛋氨酸合成酶还原酶(methionine synthase reductase,MTRR)基因发生变异可能导致表型变化而影响体内cystatin C及Hcy水平[3-5],从而可能改变ICVD的易感性,目前国内外报道较少且不一。作者采用病例-对照研究探讨CST3基因G73A及MTRR基因A66G多态性与ICVD的关系,进一步探索ICVD的易感基因。

1 对象与方法

1.1 对象 病例组为随机选取 2008年 10月至2009年 5月在郑州大学第一附属医院神经内科住院的ICVD患者,均符合中华医学会第4届全国脑血管学术会议制定的诊断标准,并经头颅 CT和(或)MRI检查确诊,共187例,其中男122例,女 65例,年龄(67.2±13.1)岁。对照组为性别、年龄与病例组相匹配的同期健康体检的随机个体及同期住院的非ICVD病例共122例,其中男79例,女43例,年龄(65.7±10.5)岁。2组均为为河南汉族人,相互无血缘关系;病例组排除外心源性脑栓塞,低血容量所致的脑梗死、无症状性脑梗死,且除外严重肝肾疾病、癫痫及恶性肿瘤等。

1.2 临床资料及标本收集 由 2名经过培训的神经内科医师严格筛查入组人员,并详细记录临床一般资料及各种危险因素。抽取禁食 12 h后清晨空腹外周静脉血4mL置于EDTA抗凝管中,储存于-40℃冰箱集中提取DNA。

1.3 M TRR和CST3基因PCR扩增与限制性片段长度多态性(RFLP)分析 用人全血基因组提取试剂盒(德国BMS公司)提取DNA,PCR引物由北京三博远志生物技术有限公司合成,PCR MigicMix购自北京天恩泽基因科技有限公司,限制性内切酶NdeⅠ和SacⅡ购自MBI Fermentas公司。①MTRR基因A 66G上游引物:5′-CAGGCAAAGGCCATCG CAGAAGACAT-3′;下游引物:5′-CACTTCCCAAC CAAAATTCTTCAAAG-3′。PCR扩增体系30μL,其中DNA模板2μL,上、下游引物各2μL,PCRMigic-Mix 15μL,灭菌双蒸水9μL。PCR反应条件:94℃预变性4 min,94℃60 s、58℃60 s、72℃60 s,共35个循环,末次循环后72℃延伸 5m in,25 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴别PCR产物。NdeⅠ37℃酶切PCR产物过夜,酶切产物用 35 g/L琼脂糖凝胶电泳,紫外线凝胶电泳成像仪内判断基因型并摄像。②CST3基因G73A上游引物:5′-GGTCCTCTC TATCTAGCTCC-3′;下游引物:5′-CTCCTGGAAGCT GATCTTAG-3′。PCR扩增体系同上。PCR反应条件:95℃预变性5 min,95℃45 s、58.6℃45 s、72℃45 s,共32个循环,末次循环后72℃延伸7 min, 20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴别PCR产物。SacⅡ37℃酶切PCR产物过夜,酶切产物用25 g/L琼脂糖凝胶电泳判断基因型。

1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0进行分析,组间基因型及等位基因频率分布分析采用 χ2检验,用优势比(odds ratio,OR)及95%可信区间(CI)估计基因突变对疾病发生的相对风险,Hardy-Weinberg平衡采用χ2检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 M TRR基因PCR扩增结果及RFLP分析结果 MTRR扩增产物片段长度为151 bp(图1)。扩增产物酶切后可产生3种基因型:野生AA型产生124及27 bp片段,突变杂合子 AG型为 124、151和27 bp片段,突变纯合子GG型为151 bp片段(图 2)。由于27 bp片段相对分子质量小,泳动速率快,琼脂糖凝胶电泳显示不出。

2.2 病例组和对照组MTRR A 66G基因型及等位基因频率比较 对照组MTRR A66G基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=3.357,P=0.067);其中GG型在病例组的分布频率35.3%高于对照组的23.0%(χ2=5.314,P=0.021),GG基因型的优势比OR为1.831(95%CI:1.091～3.073);病例组G等位基因的优势比OR为1.505(95%CI:1.086～2.087),见表1。

表1 MTRR A 66G基因型和等位基因频率分布 例(%)

2.3 CST3基因PCR扩增结果及RFLP分析结果CST3扩增产物片段长度为557 bp(图3)。扩增产物酶切后可产生3种基因型:野生GG型产生422及135 bp片段,突变杂合子GA型为557、422和135 bp片段,突变纯合子AA型为557 bp片段(图4)。

2.4 病例组和对照组CST3G 73A基因型及等位基因频率比较 对照组CST3 G73A基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=1.969,P=0.374),2组CST3G73A基因型及等位基因频率比较见表2。

表2 CST 3G73A基因型及等位基因频率分布 n(%)

3 讨论

高Hcy血症是缺血性脑血管病的独立危险因素,其对内皮细胞功能的影响是引发动脉粥样硬化病变的关键。最近研究[6]表明cystatin C参与细胞外基质降解与血管壁重构、影响粒细胞的吞噬与趋化功能,从而促进粥样硬化斑块中炎症的发生与发展[1],其相关基因多态性与心脑血管疾病的关系近年来备受人们关注。

Hcy代谢酶MTRR基因定位于5p15.2-15.3,该基因包含15个外显子,其常见的多态性位点 A66G (rs1801394),为蛋氨酸被异亮氨酸替代,导致该酶表达与功能上的改变而影响体内 Hcy水平。Gueant-Rodriguez等[5]研究认为AA基因型与高Hcy血症及冠心病有关。Naushad等[7]则认为MTRR GG型是南印度人深静脉血栓形成的危险因素,G等位基因与血浆Hcy水平呈正相关。而Bosco等[8]认为MTRR A66G基因多态性与ICVD没有关系。作者的研究结果显示MTRR A66G基因型及等位基因频率在ICVD病例组和对照组中的分布差异均有统计学意义,提示 MTRR基因多态性与河南汉族人ICVD的易感性有关,GG型在病例组的分布频率(35.3%)显著高于对照组(23.0%)。说明GG基因型是ICVD的易感基因型,这与国外研究结果不一致,可能为不同种族、地域的遗传背景不同和环境差异所造成遗传表型不同。

Cystatin C主要功能是抑制内源性半胱氨酸蛋白酶的活性,2者在体内的表达失衡可能导致了动脉血管壁胞外基质的损伤,是动脉粥样硬化发生发展的一个重要因素[9]。cystatin C的编码基因CST3位于染色体20p11.2,全长 7 292 bp,包括 3个外显子,CST3多态性已成为近年来研究的热点。Eriksson等[10]研究了CST3基因7个多态性位点与冠心病的关系,发现CST3启动子2个(-82G/C和-78T/G)突变单倍体人群与cystatin C的低水平表达明显相关,同时发现这 2个突变单倍体人群冠状动脉狭窄数目明显增高,表明CST3基因多态性与冠心病相关。作者发现河南汉族人群 CST3基因G73A位点存在多态性,但与ICVD发病无关,可能不是其的遗传影响因素。

综上所述,MTRR基因A66G多态性可能与ICVD相关,而CST3基因G73A多态性可能与其无关,但ICVD是由多个易感基因的微小表型效应累积到一定程度,再加上环境因素共同作用的结果,且基因多态性很大程度上受到种族、地域不同的影响,因此有待进一步扩大样本进行多民族地域间的研究来探讨ICVD的易感基因,为其防治提供科学依据。

[1]Keller C,Katz R,Cushman M,et al.Association of kidney function with in flammatory and procoagulantmarkers in a diverse cohort:a cross-sectional analysis from the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis(MESA)[J].BMC Nephrol,2008,9:9

[2]NiccoliG,ConteM,Della Bona R,etal.Cystatin C is associated with an increased coronary atherosclerotic burden and a stable plaque phenotype in patients with ischemic heart disease and normal glomeru lar filtration rate[J]. Atherosclerosis,2008,198(2):373

[3]Noto D,Cefalu'AB,Barbagallo CM,etal.Cystatin C levels are decreased in acutemyocardial infarction:effectof cystatin CG 73A gene polymorphism on plasma levels[J].Int JCardiol,2005,101(2):213

[4]Pozzi E,Vergani P,Dalp ràL,et al.Maternal polymorphisms formethyltetrahydrofolate reductase and methionine synthetase reductase and risk of child ren with Down synd rome[J].American JObstet and Gynecol,2009,200(6): 636.e1

[5]Gueant-Rodriguez RM,Juilliere Y,Candito M,et al.Association of MTRRA 66G polymorphism(but not of MTHFR C 677T and A1298C,MTRA 2756G,TCN C776G)with homocysteine and coronary artery disease in the French population[J].Thromb Haemost,2005,94(3):510

[6]Sukhova GK,Wang B,Libby,etal.Cystain C deficiency increases elastic lamina degradeation and aortic dilatation in apilipoprotein E-null mice[J].Circulation Res,2005,96 (3):368

[7]Naushad SM,Jain Jamal MN,Prasad CK,et al.Relationship between methionine synthase,methionine synthase reductase genetic polymorphisms and deep vein thrombosis among South Indians[J].Clin Chem Lab Med,2008,46 (1):73

[8]Bosco P,Guéant-Rodriguez RM,Anello G,et al.Association of homocysteine(but not of MTHFR 677 C＞T,MTR 2756 A＞G,MTRR 66 A＞G and TCN 2 776 C＞G)with ischem ic cerebrovascular disease in Sicily[J].Thromb Haemost,2006,96(2):154

[9]Seliger SL,Longstreth WT Jr,Katz R,etal.Cystatin C and subclinicalbrain infarction[J].JAm Soc Nephrol,2005, 16(12):3 721

[10]Eriksson P,Deguchi H,Samnegard A,et al.Human evidence that the cystatin C gene is implicated in focal progression of coronary artery disease[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24(3):551