氯化锰对大鼠睾丸间质细胞睾酮合成及去势大鼠生殖内分泌的影响*

高慧艳,李春阳,苏晓东,尚平平,陈小玉#

1)郑州大学公共卫生学院卫生毒理学教研室郑州 450001 2)郑州烟草研究院郑州 450001

#通讯作者,女,1957年11月生,硕士,教授,研究方向:生殖与发育毒理,E-mail:chen-xiaoyu@zzu.edu.cn

锰是人体的一种必需微量元素,但是过量的锰可对人的神经系统、免疫系统和生殖系统产生毒害作用。过去人们对锰毒性的研究多集中在神经系统方面,近年来随着生殖毒理、生殖流行病学和生殖生化领域研究的发展,锰对雄性生殖系统的损害日益受到关注。研究[1-2]显示,锰对多种雄性动物生殖系统有损害作用。作者观察了氯化锰对大鼠体外培养的睾丸间质细胞(leydig细胞)睾酮合成的影响及氯化锰对雄激素依赖组织、血清睾酮(testosterone,T)和前列腺特异抗原(prostate specific antigen,PSA)水平的影响,以观察锰的抗雄激素样作用。

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物:成年雄性健康SD大鼠,体质量(220±20)g,由河南省实验动物中心提供,许可证号:SCXK(豫)2005-0001,动物级别二级。②主要试剂:氯化锰(分析纯),天津瑞金特化学品有限公司提供;氟他胺,江苏天士力帝益药业有限公司提供;丙酸睾酮(TP)注射液,上海通用药业股份有限公司提供;F12培养基、DMEM培养基、台盼蓝以及Ⅱ型胶原酶均购于Sigma公司;人绒毛膜促性腺激素(HCG)购于上海第一生化药业公司;Percoll分离液购于Phanacia公司;T检测试剂盒购于北京北方生物技术研究所;125I-PSA免疫放射分析试剂盒购于北京科美东雅生物技术有限公司。

1.2 leydig细胞的分离及纯化 参照文献[3-4]的方法,并适当改进。

1.3 不同浓度的氯化锰对leydig细胞存活率的影响 用DMEM/F12培养基将leydig细胞密度调整至1.0×105mL-1,接种于24孔板,培养 24 h后,更换为含 1.0×10-6、2.5×10-6、5.0×10-6、1.0× 10-5、2.5×10-5、5.0×10-5和 1.0×10-4mol/L氯化锰的培养基,每个剂量设 6个复孔,并设对照组,继续培养。24 h后,台盼蓝染色计算细胞存活率。实验重复3次。

1.4 基础状态和HCG刺激下氯化锰对leydig细胞T分泌的影响 leydig细胞接种于24孔板培养24 h后,分别更换为加和不加10.0 kU/L HCG的含1.0×10-6、2.5×10-6、5.0×10-6、1.0×10-5、2.5× 10-5、5.0×10-5与1.0×10-4mol/L氯化锰的培养基,每个剂量设 6个复孔,并设对照组,继续培养。24 h后,采用放射免疫法测定 T含量。实验重复3次。

1.5 各组去势大鼠血清T与PSA水平及雄激素依赖组织脏器系数测定 SD大鼠适应实验环境 1周后,腹腔注射20 g/L戊巴比妥钠,麻醉完全后行睾丸摘除术,7 d后随机分为6组(每组10只):溶剂对照组皮下注射玉米油0.2m L;阴性对照组皮下注射TP 1.0μg;氯化锰低、中、高剂量组在皮下注射1.0μg TP后,分别腹腔注射氯化锰7.5、15.0和30.0 mg/kg;阳性对照组在皮下注射1.0μg TP后,腹腔注射氟他胺100.0mg/kg,1次/d,连续7 d。于末次给药后24 h,称取质量,用戊巴比妥钠麻醉后股动脉采血,分离血清,采用放射免疫法分别测定 T和PSA含量;采血后处死动物,迅速剥离雄激素依赖组织腹侧前列腺、精囊腺、尿道球腺、肛提肌和球海绵体肌(LABC肌)等,剔除周围结缔组织和脂肪,吸干表面血渍,于万分之一天平上称量以上剥离组织的湿质量,计算脏器系数,脏器系数 =脏器湿质量/大鼠体质量。

1.6 统计学处理 应用SPSS 13.0对各组leydig细胞存活率、基础状态及HCG刺激下 T分泌水平、各组大鼠血清T和PSA水平及雄激素依赖组织的脏器系数行单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组leydig细胞存活率及T分泌水平比较见表1。

表1 各组leydig细胞存活率及T分泌水平比较(n=3)

2.2 各组去势大鼠血清T与PSA水平及雄激素依赖组织脏器系数比较 见表2。

表2 各组去势大鼠血清T与PSA水平及雄激素依赖组织脏器系数比较(n=10)

3 讨论

睾丸leydig细胞的主要功能是合成和分泌T,并受黄体生成素(LH)调控。体外培养的leydig细胞不存在体内相互作用的环境,失去了促性腺激素的节律性刺激作用,分泌雄激素的量大大减少。HCG与LH有相同的受体结构,可替代体内LH的作用刺激 leydig细胞合成 T[5]。因此,作者采用HCG刺激leydig细胞分泌T。研究结果显示,无论是在基础状态还是HCG刺激状态下,随氯化锰染毒剂量的升高,leydig细胞分泌T呈下降趋势,说明氯化锰可抑制体外培养的leydig细胞合成T,原因可能是锰影响了 T合成过程中各种酶的功能[6],从而导致leydig细胞分泌T能力的下降。另一方面,随着氯化锰剂量的升高,leydig细胞存活率下降,故不排除氯化锰对leydig细胞的直接影响导致T分泌能力的下降。

Hershberger实验是最常用的筛检环境抗雄激素物质的体内短期实验方法,敏感而迅速[7]。该研究Hershberger实验结果显示,染毒组去势大鼠血清T与PSA水平均高于阳性对照组,但与阴性对照组比较,差异无统计学意义,可能是氯化锰对外源性激素水平的影响不敏感。此外,高剂量氯化锰可使去势大鼠的雄激素依赖组织腹侧前列腺及精囊腺的脏器系数减小,提示腹侧前列腺及精囊腺对氯化锰的雄激素抑制作用较敏感,在血清激素水平变化微弱的情况下,雄激素依赖组织依然对氯化锰的抑制作用表现明显,说明锰可能有拮抗雄激素的作用。

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