非酒精性脂肪性肝病患者肝组织脂联素表达及其意义

赵彩彦 孔令波 李亚 王亚东 周俊英 甄真

非酒精性脂肪性肝病患者肝组织脂联素表达及其意义

赵彩彦 孔令波 李亚 王亚东 周俊英 甄真

目的 探讨肝组织脂联素表达在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)发病机制中的作用及地位,为 NAFLD的预防及治疗提供新的思路。方法 47例 NAFLD患者及 20例正常对照均测量身高、体重,计算体重指数(BMI);分别应用ELISA方法测定血清脂联素(adiponectin)浓度、血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度;采用稳态模式评估法,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);对肝组织进行 HE、Masson染色及脂联素免疫组化染色,对脂联素表达量进行半定量分析。结果 非酒精性脂肪性肝炎(NASH)组肝组织脂联素表达较对照组及单纯性脂肪肝组显著减少(P＜0.05),与血清脂联素浓度呈显著正相关(P＜0.01),与血清 TNF-α浓度、ALT、HOMA-IR及肝组织炎症、纤维化程度呈负相关(P＜0.01),而与脂变程度不相关(P＞0.05)。多元线性逐步回归分析显示,肝组织脂联素表达是肝组织炎症及纤维化发生的保护因素。结论

肝组织脂联素表达在NAFLD患者肝组织炎症及纤维化发生发展中起保护性作用。

脂联素;脂肪肝,非酒精性;肝组织

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是代谢综合征在肝脏的表现。脂联素是一种近年新发现的脂肪细胞因子,有胰岛素增敏、抗炎等作用[1]。本实验应用免疫组化染色方法,研究脂联素在 NAFLD患者肝组织的表达情况及其与胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平及肝组织病理改变的关系,揭示肝组织表达的脂联素在NAFLD发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2006年 7月至 2007年 6月于我院就诊的NAFLD患者 47例,男 26例,女 21例;平均年龄(44±14)岁,符合中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组 2006年2月修订的 NAFLD临床诊断标准[2],其中 16例行肝组织活检经病理证实。根据有无 ALT升高或肝组织病理结果,分为非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)组及单纯性脂肪肝组。对照组 20例,男 10例,女 10例;平均年龄(41±13)岁;其中健康献血员 15例,行肝血管瘤切除术者 5例。3组年龄、性别比等差异无统计学意义(P＞0.05)。

1.2 材料 脂联素单克隆抗体,购自英国abcam公司;脂联素及 TNF-α酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购于美国 RB公司。

1.3 体重指数(bodymass index,BMI)及生化指标测定 所有研究对象均测量身高及体重,计算 BMI=体重(kg)/身高(m)2;ALT、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)用日本Olympus AU 2700全自动生化分析仪检测;空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)水平用放射免疫法测定。采用稳态模式评估法(homeostasismodel assessment,HOMA)计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),HOMA-IR=FINS×FBG/22.5,取自然对数后成为正态分布。

1.4 血清脂联素及 TNF-α浓度 ELISA方法测定。

1.5 病理检查 将肝活检组织及肝血管瘤切除术中所取正常肝组织进行石蜡包埋,制成 5μm厚连续切片。HE染色观察普通病理,每张切片随机选择 10个视野,20倍物镜下计算平均脂变肝细胞百分比;炎症活动度根据美国NASH临床研究协会2005年制定的NAFLD组织学评分系统[3]进行评分,积分标准分为小叶内炎症(L,0～3)、肝细胞气球样变性(B,0～2)、汇管区炎症(P,0～1),由富有经验的病理科医生在不知分组的情况下作出评分,将各种病理变化评分相加得到总积分,记分公式为 L+B+P。Masson染色观察纤维化程度。

1.6 免疫组化染色 采用 Power Vision TM二步法：将石蜡包埋的肝组织制成 5μm厚连续切片;常规脱蜡至水;高压修复抗原;3%H2O2溶液室温孵育 10m in;胃蛋白酶消化,37℃孵育30min;滴加鼠抗人脂联素单克隆抗体,4℃过夜;滴加山羊抗小鼠 IgG抗体-HRP多聚体,37℃孵育 30min;滴加 DAB显色剂,显色 2min,自来水终止显色;苏木精复染,中性树胶封片。PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。棕黄色着色为阳性表达。

1.7 病理图像分析 肝组织脂联素表达量及胶原纤维含量采用多功能病理图像分析仪(北京航空航天大学图像中心研制)进行分析。20倍物镜下计算平均面密度(阳性面积与统计场面积百分比),以平均面密度作为半定量分析指标。

1.8 统计学分析 应用 SPSS 13.0统计软件,计量资料以±s表示,比较用单因素方差分析或用Kruskal-Wallis H检验,LSD-t法或 Nemenyi法进行组间比较,相关分析用直线相关及多元线性逐步回归,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMI、生化指标及血清脂联素浓度 单纯性脂肪肝组及NASH组BMI及 HOMA-IR显著高于对照组(P＜0.01),单纯性脂肪肝组与 NASH组之间差异无统计学意义(P＞0.05);NASH组ALT、TNF-α显著高于单纯性脂肪肝组及对照组 (P＜0.01),单纯性脂肪肝组与对照组之间差异无统计学意义(P＞0.05);血清脂联素浓度在 3组各不相同,从高到低依次为对照组、单纯性脂肪肝组、NASH组(P＜0.01)。见表 1。

2.2 肝组织病理学变化 16例行肝组织活检的患者中,单纯性脂肪肝与 NASH各占 8例。单纯性脂肪肝组患者肝细胞存在不同程度脂肪变性;NASH组患者肝组织存在肝细胞脂肪变性,小叶内有炎性细胞浸润、点状或灶性坏死,有窦周纤维化,汇管区可见炎性细胞浸润,向小叶内延伸,偶见P-V桥接坏死。

2.3 肝组织脂联素表达 肝组织免疫组化染色可见脂联素主要表达于肝窦内皮细胞及汇管区血管内皮细胞,在炎性坏死区域也有表达(图1),单纯性脂肪肝组及对照组肝组织脂联素表达量显著高于 NASH组(P＜0.01),单纯性脂肪肝组与对照组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 2。

图1 肝组织脂联素表达(免疫组化 ×200)

2.4 相关性分析

2.4.1 血清脂联素浓度的相关分析：所有 NAFLD患者血清脂联素浓度与 BMI、HOMA-IR、血清 ALT、TNF-α浓度呈显著负相关(r分别为 -0.623、 -0.614、-0.809、 -0.664,P＜0.01)。

2.4.2 肝组织脂联素表达的相关分析：在行病理检查的NAFLD患者中,肝组织脂联素表达量与血清脂联素浓度呈显著正相关,(r=0.821,P＜0.01);与 BMI、HOMA-IR、血清 ALT、TNF-α浓度、肝组织炎症活动度及胶原纤维含量呈负相关,(r分别为 -0.550、 -0.529、-0.805、 -0.739、 -0.783、 -0.798,P＜0.01);与肝脂变程度不相关(P＞0.05)。

2.5 多元线性逐步回归 对行病理检查的NAFLD患者,采用多元逐步回归法,以肝组织炎症(Y)为应变量,以肝组织脂联素表达量(X1)、血清脂联素浓度(X2)、BMI(X3)、HOMA-IR(X4)及血清 TNF-α浓度(X5)为自变量建立回归方程,在0.05水准,肝组织脂联素表达量及血清TNF-α浓度进入方程,Y=-3.401-57.473×1+2.83×5,R2=0.756。说明 NAFLD患者肝组织局部表达的脂联素在肝组织炎症的发生中起保护性作用。以肝组织胶原纤维含量(Y)为应变量,以肝组织脂联素表达量(X1)、血清脂联素浓度 (X2)、BMI(X3)、HOMA-IR(X4)及血清TNF-α浓度(X5)为自变量建立回归方程,在 0.05水准,肝组织脂联素表达量及血清 TNF-α浓度进入方程,Y=-0.031-0.507×1+0.035×5,R2=0.836。说明 NAFLD患者肝组织局部表达的脂联素在肝组织纤维化的发生中起保护性作用。

表1 3组 BMI、生化指标及血清脂联素浓度比较±s

表1 3组 BMI、生化指标及血清脂联素浓度比较±s

注：与对照组比较,＊P＜0.01;与单纯性脂肪肝组比较,#P＜0.01

组别 BM I(kg/m 2) HOMA-IR(对数值) ALT(U/L) TNF-α(pg/m l) 脂联素浓度(μg/m l)对照组(n=20) 20.3±2.1 1.18±0.20 19±3 2.02±0.16 3.81±0.4单纯性脂肪肝组(n=28) 27.9±2.9＊ 2.18±0.28＊ 21±8 2.16±0.16 2.8±0.6＊NASH组(n=19) 28.3±1.9＊ 2.19±0.33＊ 75±14 2.66±0.38＊# 1.3±0.3＊#F/H值 72.971 96.367 40.542 32.316 159.246 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表2 3组肝组织脂联素表达量及肝组织病理改变比较±s

表2 3组肝组织脂联素表达量及肝组织病理改变比较±s

注：与对照组比较,＊P＜0.01;与单纯性脂肪肝组比较,#P＜0.01

组别 脂联素表达量(%) 肝脂变(%) 炎症活动度(分) 胶原纤维量(%)对照组(n=5) 4.2±0.8 1.2±1.0 0 2.00±0.21单纯性脂肪肝组(n=8) 3.3±0.3 42.5±19.5＊ 0 2.23±0.25 NASH组(n=8) 1.8±0.6＊# 42.9±18.8＊ 3.63±1.06 5.87±1.19＊#F/H值 32.525 10.945 17.667 15.731 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

3 讨论

脂联素在 NAFLD的发生发展中起着保护性作用。尽管有研究报道,脂联素通过减少脂质合成,增加脂肪酸氧化,减少肝脏脂质含量[3]。但是,在本研究中,肝组织脂联素表达量在单纯性脂肪肝组与对照组之间无差异,在NASH组却显著降低,并且与肝组织炎症及纤维化程度密切相关,与肝脂变程度不相关,提示,肝组织表达的脂联素在肝脏主要发挥其抗炎、抗纤维化作用。

本研究发现,血清脂联素浓度及肝组织脂联素表达量均与炎症因子 TNF-α水平呈负相关,肝组织脂联素表达量与肝组织炎症程度呈负相关,多元逐步回归分析提示 NAFLD患者肝组织局部表达的脂联素在肝组织炎症的发生中起保护性作用。脂联素刺激抗炎因子的释放、抑制炎性因子的产生是其抗炎作用的主要体现。脂联素可以抑制脂肪组织C-反应蛋白及TNF-α产生;通过环磷腺苷/蛋白激酶 A依赖的信号途径抑制内皮细胞 IL-8、血管细胞粘附分子-1及反应性氧簇产生;通过刺激环氧合酶-2/前列腺素 E2途径抑制心肌细胞 TNF-α产生;通过抑制 Toll样受体介导的 NF-κB活化减少巨噬细胞 TNF-α及 IL-6产生,通过增加IL-10产生增加金属蛋白酶组织抑制剂-1产生[5]。在肝脏,脂联素可能通过这些途径发挥其抗炎作用。脂联素表达减少使其在肝脏的抗炎作用减弱,导致炎症的发生发展。另外,脂联素与 TNF-α可以抑制对方的表达,并抑制对方在靶器官的作用[6],在肝组织发生炎症后,表达增加的 TNF-α可能抑制了脂联素在肝脏的表达及其抗炎作用,使脂联素抑制TNF-α的作用减弱,因此形成恶性循环,使炎症进一步发展。

在本研究中,肝组织脂联素表达量与肝组织胶原纤维含量呈负相关,多元逐步回归分析提示 NAFLD患者肝组织局部表达的脂联素在肝组织纤维化的发生中起保护性作用。转化生长因子-β1(transforming growth factor,TGF-β1)及肝星状 细胞(hepatic stellate cells,HSC)在肝纤维化发生中起着关键作用。有研究发现,与相同处理条件下野生型小鼠相比,脂联素基因敲除小鼠在经四氯化碳刺激 12周后,血浆 TGF-β1、结缔组织生长因子水平明显升高,肝脏发生广泛的纤维化,证实脂联素可以通过抑制 TGF-β1、结缔组织生长因子表达阻止肝纤维化的发生[7]。另外,在小鼠HSC培养过程中发现,静止状态HSC可以表达脂联素 mRNA及脂联素蛋白,脂联素通过减少 α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)和增殖细胞核抗原表达抑制活化HSC的增殖与迁移,并促进其凋亡,抑制肝纤维化的发生发展[8]。另外,TNF-α除了参与炎性反应外,还可以通过激活HSC等途径参与肝纤维化的发生,所以,脂联素的抗纤维化作用还与其对TNF-α抑制作用相关。

本研究显示,脂联素主要表达于肝窦内皮细胞、汇管区血管内皮细胞,炎症区域也有表达,肝细胞没有表达。现在已经发现了Ⅰ、Ⅱ两型 G蛋白偶联脂联素受体,其中Ⅱ型主要表达于肝细胞膜[9],脂联素在上述细胞及区域表达后,通过旁分泌途径作用于肝细胞膜上受体。脂联素与其受体结合后通过活化一磷酸腺苷活化的蛋白激酶以及激活 p38丝裂原激活的蛋白激酶两个途径,引起下游一系列分子活性的改变,发挥其生物学作用[10]。在本研究中,NASH组患者肝组织脂联素表达较单纯性脂肪肝组及对照组减少,单纯性脂肪肝组与对照组之间无差异,而血清脂联素浓度在 NASH组低于单纯性脂肪肝组及对照组,单纯性脂肪肝组低于对照组。在NAFLD发生时,脂联素在其他组织的表达量也发生改变,并影响血清脂联素浓度。有研究证实,在 NAFLD患者,脂肪组织脂联素 mRNA表达量减少[11]。

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10 刘利梅,赵亚莉,李丽,等.脂联素的信号转导通路.生理科学进展,2005,36：130-132.

11 杨辉,李瑜元,聂玉强,等.非酒精性脂肪肝患者胰岛素抵抗与脂联素基因表达的关系.中华肝脏病杂志,2007,15：525-528.

Exp ression and significance of adiponectin in liver of patientswith nonalcoholic fatty liver disease

ZHAO Caiyan＊,KONG Lingbo＊,LIYa,eta l.＊Department of In fectious Disease,The Third Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050051,China

Objective To investigate the changes of expression of adiponectin in the liver and their significance in patients with nonalcoholic fatty liverdisease(NAFLD).M ethods 47 patientswith NAFLD and 20 healthy subjects were chosen in our study.Serum adiponectin and tumor necrosis factor-α(TNF-α)were quantified by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).The levels of body mass index(BMI),alanine aminotransferase(ALT),fasting blood glucose and fasting insulin were also assayed.Insulin resistance(IR)was estimated by using the homeostasis model assessment(HOMA).The histological manifestation of liver was analyzed by HE and Masson staining.The expression of adiponectin in the liver was detected by immuno histochemical staining,and the relative quantity ofadiponectin was assessed by sem iquantitative analysis.Resu lts

The relative quantity ofadiponectin in liver of NASH patients was remarkably lower than that in simple steatotic liver and normal liver.The expression ofadiponectin in the liver was positively correlated with the levels of serum adiponectin,and negatively correlated with the levels of serum TNF-α,ALT,HOMA-IR and the degreeof hepatic inflammation and fibrosis.The mu ltivariant linear gradual regressive analysis showed that the exp ression of adiponectin in the liver was a p rotective factor of hepatic inflammation and fibrosis.Conclusion The exp ression of adiponectin in the liver acts as a protective factor in the developmentof inflammation and fibrosis in NAFLD.

adiponectin;fatty liver;nonalcoholic

R 575

A

1002-7386(2010)05-0522-04

050051 石家庄市,河北医科大学第三医院感染科(赵彩彦、孔令波、王亚东、周俊英、甄真),中心实验室(李亚)

2009-11-13)