组织工程心脏瓣膜

马金辉 综述 李温斌 审校 首都医科大学附属北京安贞医院（北京100029）

组织工程心脏瓣膜

马金辉 综述 李温斌 审校 首都医科大学附属北京安贞医院（北京100029）

在心脏外科领域中，人工心脏瓣膜置换术是治疗心脏瓣膜性病变的主要外科治疗手段，然而，临床上可以使用的人工心脏瓣膜存在不同程度的缺陷。随着组织工程技术的发展，组织工程心脏瓣膜被认为是一种潜在的理想的人造瓣膜,具有非常重要的临床应用前景,是目前心脏瓣膜外科领域研究热点之一。本文对近年来组织细胞来源和种植、瓣膜支架材料、体外预适应和动物试验等方面的内容进行了综述,并指出目前研究中所存在的问题。

组织工程 心脏瓣膜 动物试验

Abstract:In the feld of cardiac surgery, valve replacement is an effective approach to treat valve disorders,however, all of heart valves can be used clinically have different degrees of impairment. With the development of tissue engineering, tissue-engineered heart valve is considered a potential and perfect valve, which has bright clinical future,and now it has become a hot area of research. In this article, the resource of tissue cells and implantation, valve scaffold, in vitro pre -adaptation testing and in vivo animal experiment results are reviewed and the problems that in the current study are pointed out.

Key words:tissue engineering, cardiac valves, animal testing

人工心脏瓣膜置换术是治疗心脏瓣膜性病变的主要外科治疗手段，目前临床上可以使用的人工心脏瓣膜主要有三类，即机械瓣、生物瓣和同种异体瓣。虽然可以有效地改善血流动力学，提高病人的生活质量，延长寿命，但仍然存在不同程度的缺陷[1]。机械瓣需要终身抗凝防止血栓形成，异种生物瓣和同种瓣容易钙化和衰败。尤其这些管道共同缺点是都不具有生长潜能，在小儿心脏手术应用中明显受到限制[2]。作为理想的瓣膜替代物，尚不能令人满意。理想的人工心脏瓣膜应该具有耐久性能好、无钙化和衰败，能够随身体的发育而生长，并且材料来源广泛、型号多样等特点，它能够满足不同年龄段患者的需要。组织工程瓣膜正是这样一种综合了以上种种优点的瓣膜替代品[3]。

1 组织工程心脏瓣膜概念

组织工程（Tissue Engineering，TE）是近年来正在兴起的一门新学科，属于生物高技术范畴。TE一词最早是在1987年美国科学基金会在华盛顿举办的生物工程小组会上由美国化学工程师Robert Langer和外科医生Joseph.p.Vacanti提出[4]，1988年正式定义为：应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。它涉及细胞生物学、分子生物学、化学、生物材料工程、临床等诸多领域，属于系统的多学科性研究范畴。TE的核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体，其最大优点是可形成具有生命力的活体组织，对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代和完美塑形。

组织工程心脏瓣膜（Tissue Engineering Heart Valve TEHV）就是利用生命科学和TE技术，采用人工合成材料、同种或异种的脱细胞心脏瓣膜作为组织工程心脏瓣膜的支架，通过将体外扩增的患者自体活细胞种植在瓣膜支架上，细胞能够牢固黏附、生长，使其具有正常瓣膜组织的新陈代谢功能，最后应用于置换病变的瓣膜，在体发挥类似于正常瓣膜的功能。因此，组织工程心脏瓣膜不仅从功能上发挥正常瓣膜的功能，而且在结构上类似于正常瓣膜， 同时由于具有活性，可在体内根据需要生长、修复、重构，并可抵御感染入侵[5]。目前，组织工程心脏瓣膜的研究包括组织细胞来源和种植、瓣膜支架材料、体外预适应和在体动物试验等方面的内容。

2 组织细胞来源和种植

种子细胞根据来源又可分为自体细胞、同种异体细胞和异种细胞。在组织工程中，由于种子细胞的来源不同会引发不同类型与程度的免疫排斥反应，因此选择合适的种植细胞是构建TEHV的关键之一[6]。

2.1 自体细胞

主要包括：a、血管内皮细胞； b、成纤维细胞和平滑肌细胞； c、骨髓基质干细胞。组织工程心脏瓣膜的种子细胞的选取现在主要集中在自体细胞，自体细胞最大的好处是可以避免由于异体、异种细胞植入后所引起的免疫排斥反应，从而减少瓣膜的退变。种子细胞最先采用的是血管内皮细胞，这是因为随着对内皮细胞研究的深入，发现内皮细胞具有很多功能，比如内分泌、抗凝血、抗感染的功能等等。但是随着研究的深入，有作者发现心脏瓣膜的细胞组成成分中不仅仅只有内皮细胞在发挥作用[7]，成纤维细胞、平滑肌细胞等均参与心脏瓣膜基质成份的构建，如果仅采用单一的细胞成份，如内皮细胞，或平滑肌细胞/成纤维细胞等，有可能会对心脏瓣膜基质的构建产生不利影响。

由于对干细胞研究的不断深入，有作者提出骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有多向分化的潜能，在体内环境的作用下可以向多种细胞方向分化，所以可能可以满足心脏瓣膜各种细胞功能的需要[7]。Hoerstrup[7]将人骨髓干细胞种植在去细胞瓣膜支架上，在拟生态环境生物反应器中培养证明了它的可行性。新生组织显示了人类心脏瓣膜组织的形态学特点和机械特性。人骨髓干细胞表现出了肌成纤维细胞分化特性。Werner等[8]也证明MSCs可以分化诱导成为血管内皮细胞。Perry[9]应用骨髓间质干细胞作为种子细胞进行研究也获得了同样的结果。

但是并非自体细胞就是绝对合理的种子细胞选择，采用自体细胞作为组织工程心脏瓣膜种子细胞来源主要的问题有：(1)培养时间较长，一般为2～4周不等[7]，有贻误病情的可能； (2)如果采用自体细胞作为种子细胞的来源，不可能进行批量生产； (3)以及采用自体细胞作为种子细胞来源会对机体本身造成一定的创伤[10]，这些都将限制组织工程心脏瓣膜的临床应用。而且就骨髓基质干细胞而言，它是否能在体内向多种细胞分化，也还是一个有争议的问题。

2.2 同种异体细胞

目前同种异体细胞作为种子细胞来源的研究主要集中在脐带内皮细胞[11]和脐带血内皮祖细胞[12]等方面。脐带内皮细胞和脐带血内皮祖细胞最大的优势在于不会造成机体的损伤[11，16]，而且可以构建细胞库[16]，形成规模化生产，满足临床的需要。目前的研究表明，脐带内皮细胞培养技术要求低，并且该种细胞生长旺盛，容易在体外生长，并且种植在支架材料上能够行使内皮细胞的种种功能，因而是一种很有前途的细胞来源[11]。而脐带血内皮祖细胞的体外培养证明该种细胞可以稳定的表达内皮细胞的功能[12]。采用同种异体细胞最主要的顾虑在于种植以后可能引起免疫排斥造成瓣膜退变；或者患者需要服用免疫抑制药物，这就丧失了组织工程心脏瓣膜的优势。但是根据目前的研究证明干/祖细胞的同种异体移植甚至是异种移植也不会发生很强的免疫排斥，甚至异种之间进行干细胞移植也不需使用免疫抑制剂[13]。这就说明脐带血内皮祖细胞可能可以作为种子细胞的来源，并且可能不需使用免疫抑制剂。而且如果能够建立组织工程库细胞的话，脐带内皮细胞和脐带血内皮祖细胞就有可能成为供被采集者自身使用的自体细胞[16]。不过脐带血内皮祖细胞的体外培养存在培养条件要求较高，增殖缓慢等缺点[11]，对这种细胞的研究还在进行当中。

2.3 异种细胞

采用异种细胞作为种子细胞具有来源广泛、成本低廉的优点，但也具有可引发强烈排斥反应的缺点。异种细胞进入受体体内会首先引发超急性排斥反应和延迟性异种移植排斥反应。超急性排斥反应在几分钟至数小时内可发生，是由人体内预存的一种天然抗体介导的补体激活反应，该抗体能识别异种细胞表面的α1，3-半乳糖苷酶（galactosidase，Gal）抗原。α1，3-半乳糖基转移酶（galactosyl transferase，GT）可以用来合成存在于除人和灵长类动物以外的几乎全部动物细胞表面的Gal表位，而人和灵长类动物体内则存在高效价的Gal表位特异的天然抗体。Phelps[14]等成功繁育出纯合的α1，3-GT基因敲除猪，这些猪并未因不表达Gal而使其生长和健康受到不利影响。α1，3-GT基因敲除猪的获得使得有希望克服超急性排斥反应和改善异种移植排斥反应过程。异种细胞与宿主MHC不同所引发的细胞免疫排斥反应也是异种细胞移植必须面对的问题。研究表明，用三维基质包埋的内皮细胞可因抑制MHCⅡ、辅助刺激因子和黏附分子而转变宿主的免疫反应。

2.4 种植条件

目前的种植条件有两种，一种是静态种植，另一种是动态种植。所谓静态种植，就是在培养瓶或培养皿中将细胞和支架材料混合培养，使细胞能种植于支架材料上，国内目前多采用这种方案[15]。这种方法培养条件要求低，易于操作。但是国内的文献并没有在体内原位植入后，在动脉血流冲刷下，细胞是否依然附着于支架材料上的报道。国外作者多采用动态种植[16]，他们应用生物反应器，将支架材料固定于反应器中，并模拟人体动脉血流的流场，使细胞种植于支架材料上。这种方案对培养的条件要求较高，但是由于模拟了动脉的流场，所以细胞在支架材料上的粘附牢固。应该说，动态种植更有利于组织工程心脏瓣膜的体内植入。

为了能够使种子细胞顺利地种植在支架内，同时使新形成组织顺利地进行物质代谢，组织工程的支架材料必须具有一定的空间三维结构。其中材料孔隙率、孔隙的大小以及孔隙之间的相互贯通是组织工程血管支架材料最重要的指标。很多新技术应用到这一方面，如三维打印技术、电镀旋压技术、纳米技术等。近年，电镀旋压成型技术(electrospinning)的应用，为血管组织工程制造出了具有仿生三维微结构的支架。He[17]等应用电镀旋压技术制造的胶原-聚合物混合物poly(L-lactic acid)-co-poly(epsilon-caprolactone)纳米纤维材料，聚合物和胶原可以按不同比率相混合，其在形态学和化学结构上模拟了细胞外基质，在组织工程应用中有巨大潜力。近来，Hong H[18]等首次尝试利用骨髓间充质干细胞种植技术和电镀旋压成型技术构建杂交去细胞猪主动脉瓣膜支架取得了不错的效果。

3 瓣膜支架材料

研究表明，理想的支架材料应具有以下优点：[19](1)具有多孔性(highly porous)三维空间结构以利于细胞的生长和营养代谢。(2)良好的生物相容性(biocompatibility)和可控制的生物可降解性(biodegradation)以满足细胞/组织在体外和/或体内的生长。(3)材料表面适合细胞粘附、增殖和分化。(4) 降解速率通常与新组织合成速率相适应，且能在新生瓣膜细胞生成之前提供足够的机械强度，承受快速血流所产生的张力和剪切力；（5）良好的材料-细胞界面：材料应能提供良好的材料-细胞界面，利于细胞粘附、生长，更重要的是能激活细胞特异基因表达，维持正常细胞表型表达。（6）易于消毒。目前，主要采用3类支架材料：（1）去细胞成份的生物瓣（同种或异种）如猪主动脉瓣或人肺动脉瓣等；（2）天然材料，如明胶、胶原、弹力蛋白、壳聚糖、纤维蛋白凝胶（fbringel）等；（3）可降解型高分子材料：Polyglycoliacid（PGA）Poly-4-hydroxybutyrate（P4HB），Polyhydroxyoctanoate（PHO），Polyhydroxyalkanoate（PHA）等。

3.1 脱细胞瓣膜支架材料

脱细胞同种或异种组织纤维支架由于完整保留了细胞生存的三维微环境，成为细胞黏附的良好平台，其机械性能也于原组织基本相同，因此脱细胞瓣膜支架的良好特性是任何人工合成材料支架无法比拟的[20]。

3.1.1 异种脱细胞瓣膜支架材料

将异种生物瓣(如猪肺动脉瓣)经过高渗液、低渗液、酶溶液及清洗液处理后，即可达到脱细胞的目的，并且能够完整保存异种瓣膜组织内免疫原性低的细胞外间质的组织结构，再经伽马射线照射消毒灭菌后，即可获得种植人体活细胞的异体生物瓣移植物的优质支架[21]。采用这种支架不仅消除了抗原性和免疫原性，而且保持了正常瓣膜的三维空间，其纤维网络结构有利于细胞种植和生长，并且有很好的抗张强度。由于异种生物瓣组织种存活的细胞是引起受体反映的主要因素，如果清除异体生物瓣组织种原有的细胞，在组织种重建具有活性的人体细胞，即可不易引发受体的免疫排斥反映；还可能存在某些复合生长因之，可诱导调节细胞的生长和分化等[22]。其不足之处是：异种瓣膜支架存在性能难以重现；具有一定的压缩性，再体内水解的过程种不能保持空间构型抗原性消除不确定；同时也会存在某些传染病隐患等[23]。

3.1.2 同种脱细胞瓣膜支架材料

是将同种瓣膜去细胞后再种植受体细胞，可有效抑制瓣膜的炎性和免疫反应，减慢钙化衰败过程，是支架构建的另一个方向[24]。同种瓣具有优良的抗血栓、抗感染性能及良好的血流动力学效果，且移植技术日趋成熟，使用方便，广泛应用于临床治疗先天性心脏病及瓣膜病。但同种瓣移植后远期易钙化毁损，再次移植率高。

3.1.3 脱细胞方法

去细胞基质是指采用一定的方法脱除组织中的细胞成分，而保留的以细胞外胶原等为主的纤维支架，该支架基本保持原有的三维结构和理化特性。目前脱细胞的方法包括化学、酶消化法和机械法。具体到心血管领域主要有单纯去垢剂法和去垢剂、酶消化法。去垢剂目前采用较多的为Triton X-100， 十二烷基磺酸钠（SDS），和胆脂酸钠。去垢剂法首先用Triton X-100对组织进行处理后，再用SDS、Triton X-100或胆脂酸钠对组织进行脱细胞处理；而去垢剂、酶消化法去细胞包括3个基本步骤(1)将组织浸入含蛋白酶抑制剂的低渗液内；(2)含Triton X-100高渗盐溶液处理；(3)酶溶液消化处理[25]。单纯去垢剂法处理后的组织主要成分为胶原、弹性蛋白、纤维粘连素(fbronectin)及层粘连蛋白(laminin)；去细胞基质的结构与正常组织非常相似。去垢剂、酶消化法处理后的组织主要成分为弹性蛋白、非可溶性胶原和紧密连接的糖性蛋白。Lifecell公司还发展了一种去垢剂和冻干法结合的去细胞方法[26]。 在去垢剂和消化酶等的使用上有不同的观点。有学者认为SDS对瓣膜的胶原结构有损伤，而Booth等[27]应用十二烷基磺酸钠(SDS)-去氧胆酸钠(sodium deoxycholate)法脱细胞，其效果确切，未见残留细胞或细胞碎片，且组织学分析表明瓣膜的主要结构蛋白成分得以保留。石开虎等[28]对4种去细胞方法进行比较，结果表明去垢剂-酶消化法去细胞效果较好，去细胞完全，纤维支架保留完整，其后种植细胞生长也较好，而且可以控制。

目前，研究中主要应用的去细胞方法还是化学去垢剂-酶消化法。实验中一般均采用胰酶、SDS，乙二胺四乙酸(EDTA)、Triton X-100、RNA酶Ⅰ和DNA酶Ⅰ的去垢剂-酶消化法处理选取的瓣膜材料，但根据不同的材料，在处理过程中消化液浓度的选择和消化时间的控制应适当选择。

3.1.4 脱细胞在材料抗钙化中的作用

在典型的交叉连接处理过程中，虽然组织细胞破裂了，但细胞碎片仍然得以保留。这些细胞残存成分与组织早期的钙化结晶有关联。去垢剂法、酶消化法和超声法等几种方法可以脱除促使组织钙化的细胞成分和脂质。因此已被成功用于组织的去细胞化处理。电镜观察发现，组织经醚提取磷脂后再用戊二醛固定，其钙化程度较戊二醛直接固定组织明显减轻。因而可以推测脱磷脂可以减少羟磷灰石(钙化形成基础)沉积的位点。实验证明，利用氯仿或甲醇或SDS选择性的从牛心包脱除脂质，可以明显的减轻牛心包在兔体内的钙化程度。尽管钙化的机制没有完全清楚，但可以认为清除脂质和磷脂可以减轻移植组织的钙化程度。脱细胞处理(如去垢剂法)通常也同时将在钙化过程中起重要作用的蛋白多糖脱除。实验证明，对牛心包采用盐酸胍脱除蛋白多糖可以减轻钙化。但有实验表明，过多的脱除蛋白多糖可以增加钙化程度。Jorge-Herrero等[29]认为过强的脱除可导致某些紧密连接的蛋白多糖以及蛋白多糖和胶原之间的连接丧失，形成钙盐得以沉积的多孔基质。虽然有报道，在戊二醛固定组织中添加蛋白多糖可以减轻钙化，但蛋白多糖在钙化中的作用目前还不清楚。

3.1.5 脱细胞在减轻材料免疫反应中的作用

瓣膜组织中的细胞，尤其是内皮细胞表达的MHC-I和MHC-II是引起免疫反应的主要原因。去细胞化后，脱除了组织内的细胞，可以减轻或消除免疫反应。炎症反应不仅可导致组织的降解，同时也是组织钙化的又一个重要原因。有假设认为，去抗原性(如细胞表面蛋白)可以减弱体内受到的免疫攻击；因此，去细胞可以减弱甚至消除炎症反应。但是，去细胞后的细胞外基质仍然可能引起免疫反应。尽管不同种属间胶原的免疫原性实验室中可以测到，但胶原的差异很小，在临床中的实际意义很小。Kasimir MT[30]报道尽管各种去细胞方法的效果不尽相同，但都不能消除异种瓣膜的致血栓性和炎症反应。因此有人认为，尽管去细胞化可以去除组织的主要免疫原性，但是无法完全消除炎症反应。有报道称，异种去细胞基质移植后的炎症反应与重塑有关，而与排斥反应无关。

3.2 天然材料

天然可降解高分子材料多由正常组织细胞外的高分子合成，本身包含许多生物信息，能够提供细胞所需的信号。天然材料与细胞亲和性强，能为细胞的生长、增殖、分化及功能发挥提供近似体内的发生发育的细胞外基质支架条件，能使细胞聚集成组织，控制组织结构，调节细胞表型。植入体内时无或只有极低的免疫排斥反应，而且构建的组织工程瓣膜具有良好的顺应性，是组织工程心脏瓣膜支架材料发展的一个重要方向。该类材料包括胶原、明胶、甲壳素、海藻酸盐、氨基葡聚糖和脂质体等。Flanagan[31]等人用纤维蛋白制作心脏瓣膜支架，在自制的生物动态反应器中进行动态培养，发现该支架材料在低压动态环境下能增加细胞黏附和取向。天然材料的另外一种使用方式是凝胶。近年来，对多种天然水凝胶材料，如将胶原蛋白，纤维素和壳聚糖几种材料混合起来形成各种支架材料，这类支架材料也可作为载体成为可注射型支架。这类材料在注射的状态下具有可流动性(溶胶)，注射入体内后经过物理和化学变化后形成具有一定形状和机械强度的支架(凝胶)。Flanagan[32]等用胶原蛋白(collagen)和葡萄糖氨聚糖(glycosaminoglycan)的水凝胶材料作为冠状瓣膜(mitralvalve)体外培养支架材料，通过研究发现这种材料是适合瓣膜体外培养的。

3.3 人工合成可降解高分子材料

最初应用人工合成聚乙醇酸(polyglycolicacid，PGA)、聚乳酸(polylacticacid，PLA)或二者共聚物(copolymer PLGA)。这类材料具有良好的组织相容性、生物可降解性和吸收性，但材料厚而硬，强度和可屈性不够。聚乙醇酸结晶度高，是线性脂肪族聚酯化合物易于吸收降解，细胞易附着，但存聚乙醇酸缺乏结构的稳定性，在组织培养的过程中不能抵抗平滑肌细胞产生的收缩力，降解速率快，很难维持预先设计的形态。聚乳酸相对于聚乙醇酸具有疏水性大、结晶性低、降解速率慢的特点。因此将聚乙醇酸和聚乳酸按一定的比例混合，以更好的控制降解速率和保持预先设计的形态。研究发现将聚乳酸/聚L-乳酸和聚乙醇酸按照一定的比例混合可以更好的控制降解速率和保持预设形态。心脏瓣膜组织工程中常用90%的聚乙醇酸和10%的聚乳酸混合，作为心脏瓣膜支架材料。Breuer等[33]在该材料上种植自体同源的成纤细胞和内皮细胞后，移植到小羊心脏内，替代肺动脉取得成功。也有研究者将几种聚合物的均聚物、共聚物和混合物作为支架材料。

虽然人工合成材料的强度、降解速度、微结构和渗透性均可在生产过程中进行控制，人工合成降解材料构建TEHV动物实验虽然取得了一定进展，但人工合成材料缺乏细胞外基质中的生物信号和功能基团，与种子细胞的黏附性较差；而且，在材料降解过程中，会产生一些酸性物质，对局部会产生一定的影响；此外寻找理想的聚合物仍是一大难题，聚合物的免疫原性、细胞毒性、炎症反应很难避免。聚合支架的重要参数包括孔隙率、厚度、降解率和形状正在寻找。

3.4 其他支架材料

高分子材料可以提供一个稳定的力学环境且易成型，而天然生物材料中一些氨基酸残基序列如精氨酸甘氨酸天冬氨酸(RGD)、精氨酸谷氨酰氨天冬氨酸缬氨酸(REDV)等，可以被细胞膜的整合素受体识别，参与细胞分裂，加快细胞的分化，因此可以增加细胞亲和性2004年，有多个学者报道将天然去细胞猪主动脉瓣结合人工可降解材料，或将人工可降解材料与天然材料相结合构建瓣膜支架[34]。这类混合型支架既有良好的生物相容性，易于细胞的黏附及生长，又具有与人体瓣膜相匹配的三维构型及完整的细胞外基质，能更好满足体内血流环境的力学要求。最近，SchaefermeierPK[35]等利用计算机技术设计了一种构建组织工程瓣膜三维支架的新方法：用X线扫描人的主动脉瓣，在计算机上重建三维模型，按照这个模型生产出新的硅树脂瓣膜，通过试验，这种新的瓣膜在高度、长度、内径上和同种瓣膜相比仅仅有3-4%的差异，显示了很好的效果。这种基于患者自身特殊性构建的组织工程瓣膜支架或许是未来组织工程瓣膜发展的一个方向。

4 体外预适应

生物反应器是一种可严格监控、培养环境可精细调节、操作条件可控的细胞

生物、生化培养装置。它是构建组织工程瓣膜有力的工具，既可为体外组织工程种子细胞的生长提供理想的环境，也可以为体外构建组织工程组织和器官提供模拟体内生理条件的三维环境。研究发现[36]，体外构建的组织工程瓣膜在逐渐经过模拟体内血流的生物反应器后，其功能和生物学特性均有明显改善，再行在体动物实验后的结果表明其瓣膜结构和细胞生物学特性要明显优于未经体外预适应的组织工程瓣膜。一些专门设计的反应器如脉动反应器提供了最接近体内环境的条件，使在此条件下构建的心脏瓣膜、血管机械性能远胜于静态培养!Hoertrup SP等[37]将骨髓间充质干细胞在体外增殖到一定数量后接种到三尖瓣支架上，分别置入脉动生物反应器和普通培养皿中培养，结果脉动生物反应器中培养的三尖瓣组织结构与机械性能接近人体三尖瓣，而静态培养的三尖瓣组织结构松散，生物性能远不如前者。最近，有报道[38]新型生物反应器的研制，能够提供瓣膜以脉动力学环境，模拟体内环境。该装置采用体外循环转子泵提供动力源，可达到正常心排量，并能够精确调节流量，方便计算出瓣膜所承受的切应力大小.随着生物反应器不断发展和完善，生物反应器将不仅仅是细胞、组织的培养容器，而是向着成为真正意义上能培育出生命的装置发展。生物反应器的进一步完善也必将会促进组织工程的发展。

5 构建TEHV的动物实验研究

5.1 人工合成降解材料构建TEHV动物实验

目前组织工程心脏瓣膜的应用大多局限于实验阶段，主要以大型动物实验如犬、羊等为主。最早的动物实验由1995年Shin’oka等完成[39]，他们在PGA/PGLA支架上种植了羊颈、股动脉肌纤维母细胞和内皮细胞后，将其移植于羊肺动脉瓣观察11周， 结果显示组织工程心脏瓣膜植入动物体内后是有生物活性的。人工合成降解材料构建TEHV动物实验虽然取得了一定进展，但寻找理想的聚合物仍是一大难题。聚合物的免疫原性、细胞毒性、炎症反应很难避免。基于降解材料构建的TEHV目前仍有许多无法克服的困难，许多科研机构采用脱细胞的生物源性支架构建TEHV用于动物实验，甚至初步应用于临床。

5.2 异种脱细胞瓣膜构建TEHV动物实验

Bader等[40]取猪主动脉瓣脱细胞处理，将冠状动脉旁路移植术中分离的人大隐静脉内皮细胞种植在支架上。病理检验可见脱细胞猪主动脉瓣膜胶原纤维保存完好，3日后内皮细胞融合为单层；人内皮细胞标志CD31染色阳性，体外研究已证明了用脱细胞猪主动脉瓣构建TEHV的可行性。此后他们用此法构建TEHV，在羊体内进行了实验，肺动脉置换1个月后超声检查瓣膜活动良好。

也有学者取猪肺动脉瓣脱细胞处理后构建TEHV。Dohmen等[41]将猪的肺动脉瓣取下，于无菌条件下化学法脱细胞，将获取的羊内皮细胞种植在瓣膜上，7日后替换绵羊的肺动脉瓣。分别于术后7日、3、6个月检查，瓣膜功能良好，无坠生物、血肿形成，瓣叶无撕裂、穿孔、变形、返流、变硬。病理检查及电镜示瓣叶表面内皮细胞完整，有成纤维细胞长入基质。X线和原子吸收光谱检测瓣叶钙化情况，瓣叶只在缝合线的两边有轻度的钙化。

国内方宁涛等[42]采用人脐带血分离出的内皮祖细胞在去细胞猪主动脉瓣膜上体外进行培养，发现该细胞能够在支架上分化为内皮细胞。

5.3 同种脱细胞瓣膜构建TEHV动物实验

2000年，Gudtav等[43]报道他们将羊的同种肺动脉带瓣管道经脱细胞处理后种植以羊的肌成纤维细胞和内皮细胞，再移植回该羊体内，3个月后，瓣膜的功能良好，表面有再细胞化及细胞基质的形成。不过从临床的角度来看，同种瓣膜的来源较少，同时会涉及复杂的伦理问题，都会限制其应用前景。Akatov等[44]

利用组织工程方法对同种瓣进行改造，方法是在体外用患者自身组织培育并提取的成纤维细胞和内皮细胞先后植入同种瓣，结果表明成纤维细胞已长入了同种瓣组织中，认为此法能延长同种瓣移植后的寿命。但这种方法的主要问题在于支架本身抗原性不能完全消除，置入体内后支架不能降解，且无生长性，儿童换瓣仍受到限制。

5.4 其他方法构建TEHV的动物实验

正如上所述，体外构建TEHV需要体外生物反应器才能使种植的细胞具有循环内的内皮细胞形态和功能。但是，体外生物反应器毕竟不能完全模拟体内的血液循环特点，并且瓣膜容易受到二次污染。再加上工序复杂，难以在临床上广泛推广。有许多研究者一直在致力于采用其他的方法构建TEHV。比如：心脏瓣膜支架直接移植到受体体内，在真正的血流环境下重建TEHV；也有的研究者采用其他的方法，比如对心脏瓣膜支架材料进行一定的预处理，使心脏瓣膜支架具有更好的组织相容性、机械强度，从而改善瓣膜支架特性，加速瓣膜在体内的组织重塑。

1995年Wilson等[45]率先采用去垢剂、核酶法对猪半月瓣进行了脱细胞处理，并移植于狗的肺动脉瓣区，进行观察。结果显示：(1)去细胞成分是完全的，基质的三维结构保持正常；(2)1个月后瓣膜及周围动脉壁无炎症反应；(3)瓣根部有多角形细胞植入；(4)瓣膜表面内皮化；(5)动脉壁部分细胞化。O'Brien[46]等人报道，他们将脱细胞的猪主动脉支架直接移入肺动脉瓣区，150 d后瓣膜支架有成纤维细胞长入和新的基质形成。Iwai S等[47]采用新的脱细胞方法制作脱细胞猪主动脉瓣膜支架，体外不种植细胞，直接埋置到鼠的皮下60天后发现受体细胞长入、瓣膜结构完整、钙化轻微，之后把这种主动脉瓣膜移植到犬的肺动脉位置。观察6个月，发现瓣膜完整，未见反流现象，未见明显钙化。Hayashida K等[48]采用新的方法体内构建心脏瓣膜管道，首先在体外构建心脏瓣膜支架模具，然后埋置到大鼠皮下，移植一段时间后取出心脏瓣膜管道，此时模具已经被受体细胞及纤维包裹，分离模具和纤维组织得到体内构建的心脏瓣膜管道。经体外测试其功能良好，细胞和纤维比例合适，具有活性。国内学者吴松、刘应龙等[49]采用杂交办法，以脱细胞猪主动脉瓣作为支架，用可降解聚合材料3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate， PHBHHx)涂层，构建新型复合组织工程瓣膜，再植入到绵羊肺动脉区。18周后，发现这种杂交瓣膜保持了自然瓣形态，抗拉强度显著提高；瓣膜柔软，表面光滑无血栓；免疫荧光染色检测，瓣膜新生内膜中内皮细胞呈CD31阳性反应，沿瓣表面连续排列，间质细胞呈现单克隆鼠抗人平滑肌actin(SMA)阳性反应；复合组织工程瓣膜钙含量明显低于脱细胞猪主动脉瓣。显示出复合组织工程瓣膜具有自然瓣膜的三维形态结构，良好的生物力学特性、生物相容性和细胞引导性。

6 临床应用

在临床应用方面具有开创意义的是Dohmen等[50]将体外构建的组织工程心脏瓣膜植入施行Ross手术患者的肺动脉瓣，他们采用经胸超声，磁共振和多层螺旋CT于术后3、6、12个月后随访，证实，肺动脉瓣位的组织工程心脏瓣膜仅有少许中心性返流，而且返流程度并未因时间延长而加重；一年后的随访经CT证实，该组织工程心脏瓣膜无钙化，功能良好。虽然Dohmen等采用的是同种瓣作为支架材料，并且植入部位是压力相对较低的肺动脉瓣，但是，这次临床应用的成功还是让大家看到了组织工程心脏瓣膜进入临床的曙光。

P.Simon等[51]在临床给4例儿童用去细胞猪主动脉和肺动脉带瓣管道Synergraft TM（500型和700型）（Cryolife Inc.，USA）行Ross术和右室流出道重建，结果却与前面学者的动物实验截然不同，4例儿童分别在术后2天、7天、6周和1年全部死亡，死亡原因是早期瓣膜穿孔破裂和晚期瓣膜褪变衰败所致的心源性猝死，对这种去细胞而又没有再细胞化的生物移植物做解剖学、组织学和细胞学检查发现：在管道外有纤维素鞘形成并向管内延伸导致吻合口严重狭窄；早期是严重而强烈的非特异性炎症反应，晚期有淋巴细胞反应和钙盐沉积；4例移植物上均没有自体细胞生长。研究者发现Synergraft TM在移植前存在去细胞不完全和钙盐沉积，建议应停用此产品，需要进一步改进。这表明去细胞组织工程瓣膜的研究距离临床应用还有一定的距离。

7 问题与展望

组织工程心脏瓣膜的研究方兴未艾，前景广阔。目前，存在的问题主要有以下几个方面：(1)人工可降解材料的性能不足以在现阶段应用于临床，还需要材料工作者共同能够努力；(2)去细胞异种生物瓣膜的支架制备方法不统一，有待进一步规范化；(3)种子细胞的旋转等基础研究尚待进一步的深入，以期建立理想的种子细胞库；(4)设计的各种生物反应器距离人体内血流动力学要求差距较大；体外构建的方法需进一步改进，这样构建的组织工程心脏瓣膜可以大规模应用于主动脉位置。

组织工程心脏瓣膜的研究进展较快，但距离临床应用还有很长的路要走， 需要该领域的广大工作者继续不懈的努力。相信随着研究的不断深入，人工可降解材料的不断优化，对种子细胞不断的筛选和体外构建方法的改进，组织工程心脏瓣膜必有更大的发展潜力，在不远的将来造福于广大心脏瓣膜病患者。

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Heart Valve Tissue Engineering

MA Jin-hui LI Wen-bin Beijing Anzhen Hospital of the Capital University of Medical Sciences (Beijing 100029)

1006-6586(2010)04-0035-09

R318.1

A

2010-01-26

马金辉，北京安贞医院住院医师