饲料及其原料中尿素检测方法的研究进展

扬州大学兽医学院 朱秀高 卢守英 朱静

上海市上海农场 曹慧

山东省临朐县卧龙兽医站 刘伟

江西省吉安市畜牧兽医局 刘克言

尿素是动物蛋白质补充料中应用的主要非蛋白氮物质。使用尿素一方面可以补充蛋白质饲料的不足；另一方面还能减少鱼粉等蛋白质类饲料的使用量，降低饲养成本。基于动物利用尿素的机理，一般主要将尿素用于反刍动物的养殖，且有较为严格的剂量添加要求，通常尿素在奶牛和羊精料补充料中的添加量不超过1.0%，肉牛精料补充料中添加量不超过1.5%（杨红东等，2009）。

当前报道中，关于尿素的检测方法较多，但主要应用在临床诊断、环境监测等领域。关于饲料及其原料中尿素的检测方法主要集中在对二甲胺基苯甲醛法（DMAB）的应用与改良。除此之外还有二乙酰肟法、甲酚红法、脲酶波氏法和近红外光谱法（NIS）等。本文仅就当前关于饲料及其原料中尿素检测方法的研究进行综述，以期为进一步完善和统一饲料中尿素的检测标准提供参考。

1 DMAB法

目前多数文章及标准中均使用DMAB法检测饲料或原料中的尿素，例如，SC/T 3510-1996、GB/T 19164-2003、AOAC 941-2004、ISO 6654-1991等。该方法的原理为DMAB与尿素反应，生成黄色的对二甲胺基甲醛脲，此物质的颜色深度与溶液中尿素含量成正比，因此可以通过测定在一定波长下反应溶液的吸光值来定量溶液中的尿素浓度，该反应需要在酸性条件下进行。

从相关报道来看，此方法在应用中主要涉及两方面：饲料样品的前处理和与DMAB试剂的反应。综合各方文献，样品前处理所采用的方法基本相同，即使用木炭作为吸附剂吸收饲料溶液中的色素，防止溶液浑浊对后续反应吸光值的测定产生干扰；利用乙酸锌和亚铁氰化钾反应生成亚铁氰酸锌来共沉淀样品中的蛋白等潜在干扰物质。大多研究者指出溶液中加入样品及试剂后摇匀静置20 min左右，待沉淀完全即可过滤，而武金凤等（2008）报道，应用此方法处理鱼粉样品时，为了使尿素完全提取，还需要将溶液振荡30 min再静置至沉淀沉积，这与ISO（1991）、崔淑文和马车覆（1993）的方法基本相同。根据笔者的经验，从实验结果的可靠性来考虑，实际样品测定中应用先振荡后静置的操作过程能够较好保证测定结果的准确性，减少可能由于提取引起的误差。样品经过前处理后，即可从中取适量上清液加入试管中与一定量DMAB显色剂进行反应，在这一操作中需要考虑的问题主要是待测样品液的取样量和反应温度，其中取样量与样品中的尿素浓度和反应体系的测定范围有关。翟毓秀（1993）报道，样品经过前处理，尿素含量在1%以下取15 mL、1%以上取5 mL加入25 mL反应管中，然后加水至18 mL，再加入5 mL DMAB试剂用水定容，室温放置10 min，在420 nm波长下测定溶液吸光值。崔淑文和马车覆（1993）报道，鱼粉样品经过前处理后直接取5 mL滤液于试管中，加5 mL DMAB溶液，充分振摇后置于25℃水浴中10 min，取出即可于420 nm波长下测定反应溶液的吸光值。武金凤等（2008）在实验中吸取含氮量为0.2～10 mg的滤液5～10 mL加入25 mL反应管中，再加5 mL DMAB溶液，用水定容至刻度后混匀放置20 min，实验结果表明，反应溶液在25℃水浴和常温条件下放置20 min，测定结果无显著性差异。

杨珩和吴玉生（1997）还提出了一种简单、快速的试纸条定性、半定量测定法，该方法应用预先经10%硫酸氢钾和2%DMAB溶液浸泡制备的试纸条，将其插入样品溶液中（此样品溶液无需加入木炭、乙酸锌与亚铁氰化钾处理），根据2 min内试纸条颜色的变化即可定性溶液中尿素的有无（试纸条呈黄色即为尿素阳性），其检出限为0.01%；而将测定后的试纸条与已知尿素浓度下的试纸条颜色进行对比即可实现样品溶液中尿素的半定量。

DMAB法虽然较为常用，但由于其试剂本身在420～436 nm具有较高的吸收值，所以操作过程中要严格控制显色剂的加入量，一般推荐添加试剂5 mL。陈灵华（1998）指出，试剂空白吸收程度随测定波长的增大而下降，同样波长下样品吸光值的变化则不大，所以推荐可以使用440 nm作为测定波长，这样就可以尽量减少由于试剂添加量变化而引起的误差，从武金凤等（2008）报告中的反应溶液扫描图谱也可以看到波长为420～440 nm时，吸光值无显著性变化，因此，本方法测定饲料样品的进一步实验中可以探讨在这两个波长下试剂吸收有无显著性差异，以确定反应溶液的最适测定波长。

2 甲酚红法

甲酚红是滴定分析中常用的一种指示剂，浓度为0.1%溶液的变色范围为pH 7.2～8.8（黄色变为红色），此颜色变化通过肉眼即能明显分辨。应用甲酚红法测定饲料中尿素的主要原理是尿素在脲酶水解作用下产氨而使溶液pH升高，引起甲酚红溶液颜色发生相应变化，从而根据颜色是否发生改变及深浅来定性半定量溶液中尿素的有无和含量。

当前研究一致认为该方法具有简单、快速、准确、灵敏等优势，因而可以在样品快速测定中予以推广使用。孙新来和赵慧（1990）报道，通过30多次实验分析，表明将新鲜黄豆中提取的脲酶应用于其改进的甲酚红显色法中，反应在30 s开始显色、尿素检出率达100%、灵敏度达0.01%，与购买商品化脲酶相比具有明显的经济优势。在《饲料显微镜检与质量控制手册》一书中，作者推荐测定样品时同时测定一系列尿素标准溶液（0～5%），在10～12 min观察比较样品与标准溶液的显色，可以半定量样品中的尿素浓度。孟丹胜（1994）详细介绍了应用甲酚红检测饲料中尿素含量的过程及可能遇到的问题和解决方法，其中主要包括试剂纯度和有效性的检验，测定结果假阳性和假阴性的排除。

从应用该方法检测血清尿素的报道来看，临床研究中已经开始将甲酚红法用于血清尿素的定量测定。邓福贵和李斌（1997）报道，以甲酚红为指示剂酶法测定血清尿素，其反应溶液的吸收峰为572 nm；反应在5 min即可达到平衡，且吸光值在2 h内基本保持稳定；尿素浓度在75 mmol/L内线性良好；血清中的其他物质及pH的适度变化对反应结果不会产生影响，与酶偶联速率法同时测定临床样品后所得实验结果具有较高的相关性，作者认为，应用甲酚红法测定血清尿素的灵敏度要明显高于邻甲酚酞络合剂和甲基麝香草酚蓝。根据上述试验结果分析，在目前该方法已经可以定性半定量测定饲料中尿素的情况下，下一步可以研究将该方法与DMAB法中的样品前处理过程相结合，以定量样品中的尿素。

3 二乙酰肟法

二乙酰反应又叫丁二酮反应，由Fearon于1939年首先报道，因此又称为Fearon反应。该反应初始为尿素与二乙酰反应，但由于二乙酰溶液不稳定，所以目前多使用二乙酰肟作为反应基础试剂。其基本反应原理为，二乙酰肟首先在酸性条件下解离为二乙酰和羟胺，然后二乙酰与尿素在加热的酸性条件下形成红色二嗪衍生物。此反应产物颜色深浅程度与样品溶液中尿素含量呈正比，因此可以通过测定特定波长下反应溶液吸光值来定量溶液中的尿素。目前研究已经证实向试剂中添加一定浓度硫胺脲、安替比林和金属离子等可以提高反应溶液和试剂稳定性、增加反应灵敏度等。

目前应用该方法检测饲料中尿素的报道较少，而且该方法在发展中出现了较多的改良法，各改良法之间在操作上并不完全统一，尤其是大部分方法的试剂组成不一致，造成了反应产物的多样性，主要表现在各方法的最适测定波长均不相同，而且目前也少见关于不同试剂组成方法间测定结果相关性的研究，所以各报道间均无较好的可比性。许瑾和才绍河（2001）报道，将适当处理后的样品与二乙酰肟和硫胺脲共煮后，可以通过测定反应溶液在500 nm处的吸光值来定量样品中的尿素。戴永利（2006）认为，处理过的样品溶液与二乙酰肟、硫脲和硫酸镉溶液混合后，于沸水浴12 min置水中冷却5 min，即可在540 nm处测定反应溶液的光密度（OD）值。罗若荣（2001）应用该法测定淀粉中尿素含量后指出，样品与二乙酰肟和安替比林的反应溶液最大吸收峰在460 nm，因此要在460 nm处测定溶液的吸光值。

该方法在进一步研究中，除了要继续探讨其对饲料中尿素的检测能力外，还应该对每种改良方法进行深入摸索，尽可能统一各方法的试剂组成和检测手段，以发挥该方法特异性强等的优势。

4 NIS法

NIS法是90年代以来在国内发展较快的一种饲料无损检测分析技术，其最显著的优势是分析操作简单、快速。根据美国材料与实验协会（ASTM）的定义NIS是指波长为780～2526 nm的非可见光，目前所说的NIS技术主要是指相对近红外光谱（NIRS）分析技术。当前饲料领域内已有许多关于应用该方法检测饲料营养成分或进行饲料品质控制的研究报道，但相关尿素检测的报道并不多见。 González-Martín 和 Hernández-Hierro（2008）应用NIRS技术结合光纤维远反射探针（Foss NIR System 5000），首先建立尿素、缩二脲和禽类排泄物的判别偏最小二乘法（DPLS）模型，然后用此模型检测添加有这些物质的苜蓿草粉，其精确度分别为96.9%、100%和100%，而采用改进偏最小二乘法（MPLS）计算所得到的各物质浓度与添加浓度间的校正相关系数（RSQ）和标准分析误差 （SEP）分别为尿素 0.990和0.28%、缩二脲0.991和0.29%、禽类排泄物0.925和2.08%，试验结果表明，该方法可以直接快速同时定性和定量大批量苜蓿样品中的尿素、缩二脲及禽类排泄物。

NIS作为一种新兴技术，具有良好的发展前景，特别是将其应用在进出口和商检部门，能极大地提高工作效率，该方法目前的主要缺陷是仪器价格居高不下及样品检测模型的缺少，因此后续工作中尚需进一步加大对该方法的研究力度，努力降低成本，建立适用于不同地区和样品的检测模型，从而充分发挥该方法的优势。

5 酶解波氏法

脲酶又称尿素酰胺水解酶，相对分子质量为120000～130000，广泛存在于豆类植物籽实、土壤及动物消化道内，能高度特异性水解尿素形成氨和二氧化碳。酶解波氏法原理为首先利用脲酶特异性分解样品溶液中的尿素形成氨和二氧化碳，在碱性条件下，氨与次氯酸盐反应形成氯化胺，氯化胺再与反应溶液中的苯酚和次氯酸盐反应形成奎诺氯胺，最后奎诺氯胺与溶液中的其他苯酚分子反应形成蓝色的吲哚酚，此吲哚酚在酸性条件下能够发生解离，反应产物在630 nm波长处具有最大吸收峰，且反应溶液颜色深度的变化与尿素含量成正比，因此可以通过测定反应溶液吸光值来定量溶液中的尿素。目前研究已经证实亚硝基铁氰化钠对反应具有催化作用。

虽然目前应用该方法测定饲料中尿素的研究很少，但临床医学研究中已经证实该方法的精密度和准确性要明显好于其他方法。O’Keeffe和Sherington（1983）研究了酶解波氏法、DMAB 法和酶解Conway微扩散法测定配合饲料中尿素的能力，结果显示酶解波氏法的准确性和精密度与DMAB法（EU标准）具有可比性，而且要好于酶解Conway微扩散法，结果表明，临床医学中应用的酶解波氏试剂盒能够用于测定配合饲料和新鲜青贮料中的尿素，该方法具有简单、快速、价廉和可用于自动化分析等特点。

另外，应用酶解波氏法检测饲料及原料中尿素还具有样品处理简单、干扰物质少等明显优势。所以对该方法还需深入研究，以建立一种新的有效检测饲料中尿素的方法。

除了上述几种常用方法外，还有其他一些方法也有报道，董春明和周天舒（2006）在高效液相色谱（HPLC）中采用甲醇-乙酸体系流动相对混合饲料样品中的尿素进行分析，结果发现该方法具有良好的线性，其加标回收率为95%～104%、相对标准偏差（RSD）为2.7%。

6 小结

综合分析上面几种方法，根据测定结果分析，可以分为定性和定量两类，其中定性分析有甲酚红法和NIS法两种，定量分析有DMAB法、二乙酰肟法和酶解波氏法，不过从具体操作来说，这两类并不能严格区分。例如DMAB法也可以用于定性，而甲酚红法和NIS法也能够进行定量。从方法的测定原理考虑，可以分为尿素直接测定法和尿素间接测定法，前者有NIS法、DMAB法和二乙酰肟法，后者包括甲酚红法和酶解波氏法两种。在实际应用中，我们可以考虑根据上述几种方法的各自特点及分析要求，对不同方法结合使用，建立一套完整的从现场快速检测到实验室精确分析的饲料中尿素含量检测体系，以满足既能够对大批量样品快速筛选，又可以达到精确定量的目的。

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