宠物重要疫病免疫与监测

张改平

（河南省农业科学院 农业部动物免疫学重点开放实验室；河南省动物免疫学重点实验室，郑州 450002）

随着国民生活水平的提高和生活方式的改变，我国宠物的饲养数量与种类急剧增加，宠物产业也迅速兴起，伴随而来的宠物疫病防控问题越来越突出，威胁到了人类自身的安全与公共卫生安全。尤其是发生传染性非典型肺炎（SARS）和禽流感疫情以来，宠物疫病的防控问题及这些疫病与人类的关系引起了社会的广泛关注。

早期宠物的饲养主要以犬、猫为主，随着宠物种类越来越多样化，其它种类的宠物也逐渐进入人们的生活，从犬、猫、观赏鱼、鸟、兔、龟，到比较另类的蝎子、蜘蛛、蜥蜴等，涵盖多种动物种类，包括哺乳类、鸟类、鱼类、昆虫类、两栖与爬行类等。而这些宠物多数未实施相关的免疫措施，其相关疫病的潜在危险性不容忽视，直接威胁着人类的健康与安全。

1 宠物重要疫病

宠物的疫病种类繁多，包括病毒病、细菌病和寄生虫病等，其中多数疫病为人兽共患传染病，如狂犬病、SARS、禽流感、H1N1甲型流感、埃博拉出血热、裂谷热、尼帕脑炎、西尼罗热、弓形虫病、旋毛虫病、莱姆病、鼠疫和钩端螺旋体病等，具有非常重要的公共卫生意义。近年来，重大动物源性人兽共患病在我国频频暴发流行，严重威胁我国相关产业的健康发展和公共卫生安全，造成了巨大的经济损失。例如，狂犬病疫情在我国持续存在，并重新呈现连续快速增长的趋势，南方和东部地区的狂犬病疫情居高不下，既往发病率较低的中原和华北地区疫情也急剧上升。2007年全国已有23省（区、市）984个县区报告狂犬病疫情，占全国县区总数的34.30％，全国报告死亡数高达3 300人。2002年11月～2003年7月SARS疫情在我国和世界32个国家和地区暴发流行，全球报告病例8437例，死亡813人，中国内地报告病例5327例，死亡348人。禽流感疫情持续发生，截至2010年8月3日，全球共报告人感染禽流感503例，死亡299例，死亡率59.44％，其中中国感染39例，死亡26例。2009年H1N1甲型流感全球大流行，截至2010年8月1日，疫情已蔓延214个国家或地区，全球报告H1N1甲型流感死亡病例18 449例；截至2010年3月31日，全国31个省份累计报告甲型H1N1流感确诊病例12.7余万例，其中境内感染12.6万例，境外输入1 228例，死亡病例800例。弓形虫在人体多为隐性感染，孕妇可经胎盘传染给胎儿，与优生有密切关系。目前，我国疫源地鼠疫进入活跃期，动物鼠疫疫情出现了回升趋势鼠疫疫情。此外，犬类疫病（如犬瘟热、犬细小病毒病、犬传染性肝炎、犬腺病毒病、犬副流感、犬冠状病毒病和犬轮状病毒病等）和猫类疫病（如猫瘟热、猫传染性鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫传染性腹膜炎、猫白血病和猫冠状病毒病等）也对宠物和野生动物造成严重危害，制约宠物产业健康、可持续发展。

2 宠物疫苗与免疫监测

2.1 宠物疫苗

我国是全球最大的疫苗生产国，疫苗的种类和数量为世界之最，也是世界上疫苗产品生产企业最多的国家。我国年产各种疫苗10亿人份，其中用于预防乙肝、脊髓灰质炎、麻疹、百日咳、白喉、破伤风的儿科常见病的疫苗生产量达到5亿人份，已经全部实现计划免疫接种。动物疫苗的研发和生产则主要以经济动物疫苗为主，2009年中国动物疫苗市场规模达62亿元左右，同比增长14.8％，未来动物疫苗市场规模仍将稳定上升。据统计，2008年我国动物疫苗市场猪、牛、家禽等经济型动物疫苗比例分别为44.37％、14.13％和24.22％，而宠物疫苗仅占1.66％。受国家动物疫苗采购政策影响，目前中国在口蹄疫疫苗、禽流感疫苗、猪蓝耳疫苗、猪瘟等传统的国家强制疫苗方面发展比较成熟，2009年国家强制疫苗占整个动物疫苗市场的86％以上份额，并且这部分市场基本被中牧股份、青岛易邦、金宇集团、哈药生物疫苗以及天康生物等内资企业占据，2009年上述五家企业合占中国动物疫苗市场66.7％份额，而国内市场化动物疫苗，特别是宠物疫苗进口依存度较高。

宠物疫苗市场提供的主要是用于犬和猫的疫苗，其中犬猫兼用疫苗为狂犬疫苗（荷兰英特威、美国富道、美国辉瑞、法国维克、梅利亚），犬用疫苗包括犬咳疫苗（荷兰英特威）、犬六联疫苗（荷兰英特威、美国富道、法国维克、法国优利康）、犬七联疫苗（荷兰英特威）、犬五联疫苗（百思特），猫用疫苗为猫三联疫苗（荷兰英特威、美国富道、法国维克），而其他宠物疫苗则十分匮乏。国内在宠物疫苗研究方面比较滞后，夏咸柱院士率先研制成功的“犬五联活疫苗”，预防犬瘟热、细小病毒、传染性肝炎、犬副流感、狂犬病，获得了二类新兽药证书和国家科技进步二等奖（2000），并成功进行了产业化开发，开创了中国宠物疫苗的先河，但我国自主研发的宠物疫苗产品还非常有限。国产宠物疫苗仅有犬狂犬病、犬瘟热、副流感、腺病毒病、细小病毒病五联活疫苗（吉林五星）、狂犬病活疫苗（Flury株）（浙江易邦）、犬狂犬病、犬瘟热、副流感、腺病毒和细小病毒病五联活疫苗（杨凌绿方）和犬瘟热活疫苗（CDV-11株）（齐鲁）等4种疫苗产品获得新兽药注册，并获得农业部核发的兽药产品批准文号。目前，国内宠物疫苗市场由进口疫苗占主导地位，2002年英特威狂犬疫苗注册成功，中国开始进口宠物疫苗，形成以进口疫苗产品为核心的宠物疫苗市场，销量占总体市场30％左右，销售额占总销售额的70％，主要来自美国、荷兰、法国等企业，产品在单价和市场占有率上都具有十分突出的优势。然而，上述进口宠物疫苗仅有犬细小病毒病活疫苗（美国辉瑞）、犬瘟热、腺病毒2型、副流感和细小病毒病四联活疫苗（美国辉瑞）、犬、猫狂犬病灭活疫苗（荷兰英特威）、狂犬病灭活疫苗（美国富道）、犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗（荷兰英特威）、犬瘟热、腺病毒病、细小病毒病、副流感病毒2型呼吸道感染四联活疫苗-犬钩端螺旋体病、黄疸出血钩端螺旋体病二联灭活疫苗（法国梅利亚）、狂犬病灭活疫苗（VPl2株）（法国维克）、犬瘟热、腺病毒2型、细小病毒病、副流感四联活疫苗-犬冠状病毒病灭活疫苗（美国富道）、犬瘟热、传染性肝炎、细小病毒病、副流感四联活疫苗（荷兰英特威）、犬钩端螺旋体（犬型、黄疸出血型）二价灭活疫苗（荷兰英特威）和猫鼻气管炎、嵌杯病毒病、泛白细胞减少症三联灭活疫苗（美国富道）等11种疫苗为合法注册的进口疫苗产品，宠物疫苗市场有相当一部分疫苗为非正常渠道进入国内的进口疫苗产品，严重影响我国宠物疫苗市场。在宠物疫苗知识产权方面，近10年国内科研院所或企业申报宠物疫苗相关国家发明专利11项，主要涉及狂犬病、犬瘟热等犬类疫苗，国外研究机构或公司在我国申报发明8项，涉及狂犬病、犬瘟热、犬流感、犬莱姆病、钩端螺旋体和猫杯状病毒等犬猫疫苗，但上述发明专利均尚未获得国家知识产权局授权。

此外，宠物疫苗市场也存在疫苗质量良莠不齐的现象，部分厂家生产的狂犬疫苗批次之间效价不稳定，产品检验把关不严，甚至生产销售劣质狂犬疫苗或者没有在低温（2～8）℃条件下保存、运输狂犬疫苗，影响了疫苗质量。例如，国家食品药品监督管理局在对人用狂犬病疫苗进行监督检查中发现，江苏延申生物科技股份有限公司和河北福尔生物制品有限公司2008年7～10月期间生产的7个批次人用狂犬病疫苗质量存在问题，辽宁大连金港安迪生物制品有限公司2008年生产的部分人用狂犬病疫苗中含有违法添加的核酸物质。疫苗质量监控体系和机制的缺失是导致问题疫苗频出的主要原因，因此建议系统开展疫苗质量监测技术研究，建立以抗原检测试纸等快速检测技术为基础的疫苗质量监控体系，有力保障宠物疫苗在生产和流通过程中的质量安全。

2.2 疫苗免疫与监测

疫苗免疫在动物疫病预防与控制中发挥着极其重要的作用，提高宠物疫苗的接种率是控制宠物疫病的有效手段。据WHO推荐，一个地区的犬接种狂犬疫苗的免疫率达到80％，就可以切断狂犬病的传染源，防止狂犬病在该地区流行。2010年世界狂犬病日（9.28）的主题也因此确定为：“免疫是预防动物狂犬病最有效措施”。我国饲养的犬、猫种类多，数量大、分布广，狂犬病疫情持续高发的主要原因就在于传染源数量庞大，接种率低。近年来，农村地区饲养犬只看家护院更为普遍，犬只数量大大增加。调查表明，我国南方农村地区犬密度可高达15至20只/100人，猫密度可高达5至10只/100人，平均每户至少养有1只以上犬或猫。随着经济发展，城市宠物饲养逐渐增多，犬、猫等密度也迅速增加，抽样调查结果约5只/100人。据统计，全国约有犬只7 500万。犬、猫散养现象非常普遍，农村地区几乎都是散养（90％～95％），极易发生动物间传播及动物致伤情况。此外，调查表明，我国大部分地区的犬、猫免疫率低，农村地区犬只免疫率仅为10％至20％，猫则几乎没有进行过免疫，形成不了有效的免疫屏障。

在检测试剂知识产权方面，近10年国内科研院所或企业申报宠物疫苗相关国家发明专利9项，主要涉及狂犬病胶体金检测试纸和酶联免疫试剂盒；禽流感病毒ELISA检测试剂盒、禽流感病毒乳胶凝集试验检测试剂盒、猪旋毛虫抗体快速检测试纸条、禽流感病毒检测试纸条和鹦鹉热衣原体抗体胶体金检测试纸条等5种检测试剂获新兽药证书。WHO推荐的狂犬病抗体检测标准方法为小鼠中和法和快速免疫荧光灶抑制试验（RFFIT），上述2种方法能有效反应免疫动物的中和抗体水平，对疫苗免疫效果进行评价，但需要具备相当的实验条件和技术水平，不能适应兽医临床的客观实际，目前市场上尚无合法注册的狂犬病抗体免疫检测试剂，无法对狂犬疫苗免疫抗体水平进行实时检测和监测，导致临床兽医和相关人员只能按程序进行接种和免疫，而无法明确疫苗免疫效果。因此，建议系统开展免疫抗体检测技术研究，建立以抗体检测试纸等快速检测技术为基础的免疫抗体监测体系。

3 免疫试纸快速检测技术

免疫试纸快速检测技术是在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一种新型体外检测技术，最早用于人早孕的便捷检测，是理想的即时检测（point-of-care test，POCT）和现场检测技术。该检测技术不需要专业技能和仪器，自1980年代末建立以来发展迅速，广泛应用于各种分析物的定性和半定量快速检测，包括抗原、半抗原、抗体和核酸，已成为当今最快速敏感的免疫学检测技术之一。农业部动物免疫学重点开放实验室从1995年开始系统开展免疫试纸快速检测技术研究，率先将该技术引入动物疫病快速诊断领域，建立了抗原、抗体和半抗原3类靶标物的免疫试纸快速检测技术体系，研制成功动物疫病及人兽共患病快速检测试纸和动物源食品安全快速检测试纸系列产品，检测时间仅需要数分钟，无需任何附加试剂和设备，人人均可操作，解决了传统检测方法费时（数小时至数天）、成本高（需贵重仪器或试剂）、操作复杂等问题，真正实现了长期以来人们在检测技术领域所追求的“快速、简便、特异、敏感”的目标，提高了我国在该领域的研发水平。

3.1 抗原免疫试纸快速检测技术

农业部动物免疫学重点开放实验室系统开展了鸡传染性法氏囊病（IBD）、鸡新城疫（ND）、禽流感（AI）、猪瘟（CSF）等重大动物疫病快速检测技术研究，制备和鉴定了多种动物病毒的高特异性、高亲和力配对单克隆抗体，解决了试纸研制中动物病毒抗原变异大、抗体亲和力低、识别谱窄等关键技术难题，以双抗体夹心模式建立了抗原免疫试纸快速检测技术体系，研制成功动物疫病抗原快速检测试纸系列产品，获得了国家发明专利（ZL99101537.1），开辟了动物疫病快速诊断新领域，为重大动物疫病的快速检测提供了新的技术支撑，也使我国在此研究领域居国际前沿。抗原检测试纸产品代表产品包括鸡传染性法氏囊病毒检测试纸、鸡新城疫病毒检测试纸和旋毛虫抗原检测试纸等，鸡传染性法氏囊病毒检测试纸是国内外第一个动物疫病快速检测试纸产品，2003年获国家二类新兽药证书［（2003）新兽药证字第39号］，2004年获国家技术发明二等奖。旋毛虫抗原检测试纸以自主研制的高特异性、高亲和力、配对的抗旋毛虫分泌（ES）抗原单克隆抗体为基础，特异识别旋毛虫分泌抗原，且与弓形体虫、囊虫、住肉孢子虫和细颈囊尾蚴等其它主要常发寄生虫无交叉反应，敏感性与酶联免疫吸附试验（ELISA）相当；对临床样品的检测表明，试纸与ELISA的符合率为97.22％，可用于宠物旋毛虫病的快速诊断与免疫监测，2008年获河南省科技进步一等奖。

3.2 抗体免疫试纸快速检测技术

农业部动物免疫学重点开放实验室系统开展了动物疫病抗体快速检测技术研究，建立了口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、鸡新城疫病毒（NDV）、旋毛虫等多种病原的检测抗原制备方法，解决了免疫检测抗原活性低、非特异性反应高、提取制备难等突出问题，建立了抗体免疫试纸快速检测技术体系，研制出动物疫病及人兽共患病抗体快速检测试纸系列产品，实现了动物疫病抗体水平的实时监测，为疫苗免疫效果评价和动物疫病监测提供了先进的技术手段。抗体检测试纸产品代表产品包括旋毛虫病抗体检测试纸、口蹄疫O型抗体检测试纸、传染性法氏囊抗体检测试纸、新城疫抗体检测试纸和犬狂犬病抗体检测试纸等，旋毛虫病抗体检测试纸是国内外第一个动物寄生虫病快速检测试纸产品，2007年获国家二类新兽药证书［（2007）新兽药证字36号］，成为了国内第一个获得国家新兽药证书的人兽共患寄生虫病抗体检测试纸，2008年获河南省科技进步一等奖。犬狂犬病抗体检测试纸是与军事医学科学院军事兽医研究所夏咸柱院士联合研发的抗体快速检测试纸产品，该试纸以高度纯化的狂犬病病毒为检测抗原，特异性强、敏感性高，与犬瘟热、犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒和犬冠状病毒与犬其它主要疫病血清无交叉反应，对狂犬病病毒抗体的检测限为0.001IU/mL；对临床血清样品的检测表明，试纸与快速荧光灶抑制试验（RFFIT）的符合率为98.9％，可用于犬狂犬病疫苗免疫效果评价和抗体水平监测。

免疫试纸快速检测技术特别适合于兽医临床对宠物疫病的快速诊断和免疫监测，显示巨大的发展潜力和应用前景，被认为是微生物和传染病及寄生虫病检测技术标准化最有前途的新技术之一，已成为动物疫病快速检测的主要发展趋势和热点。鉴于农业部动物免疫学重点开放实验室在免疫试纸快速检测技术研究的突出贡献，美国Humana出版集团特邀张改平为“Biosensors and Biodetection”（生物传感器和生物检测）一书撰写了“Immunochromatographic Lateral Flow Strip Tests”（免疫试纸快速检测技术），这是该技术首次被正式列入科研和教学工具书，将对该技术的广泛应用和相关领域的科技进步产生较为深远的影响。

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