碱性调宁蛋白的研究进展

王书美，张连峰

（中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021）

脊椎动物调宁蛋白（calponin）是一个家族，按其等电点（isoelectric point，pI）分为碱性调宁蛋白（h1 calponin，h1CaP，pI 8～10），中性调宁蛋白（h2 calponin，h2CaP，pI7～8），酸性调宁蛋白（h3 calponin，h3CaP，pI5～6）。h2CaP与h1CaP有很高的同源性，主要分布于心肌组织中，人角化细胞中也有其存在。h3CaP广泛表达，但在脑组织中含量最丰富。这3个成员的前273个氨基酸残基具有很高的同源性（＞70％），都是由单一CH结构域（calponin homologydomain）和29个氨基酸残基组成的CLR（calponin-like repeat）三拷贝串联重复序列组成。但它们的羧基末端序列有较大的差异。

h1CaP是肌动蛋白结合蛋白家族成员［1］，主要表达于终末分化和非增殖性的平滑肌细胞中，含量与原肌球蛋白（tropomyosin）相似，为肌动蛋白的1/7。Takahashi等［2］首先从鸡砂囊平滑肌组织中提纯出h1CaP，随后，证实血管、胃、子宫、输尿管、膀胱和输精管等组织的平滑肌细胞中均有h1CaP表达。h1CaP主要在平滑肌细胞中表达，具有很强的组织特异性，参与平滑肌收缩的调控。

1 碱性调宁蛋白的分子生物学特点

编码人h1CaP的CNN1基因位于19p13.2，小鼠的cnn1基因位于9q，大鼠的cnn1基因位于8q。编码人h1CaP的cnn1基因跨度超过11kb，包含7个外显子，人h1CaP为一297个氨基酸的蛋白［3，4］。

h1CaP分子结构主要由氨基末端的单一CH结构域和羧基末端的CLR多拷贝的串联重复序列组成［5］。单一CH结构域与MAPK（mitogen—activated protein kinase）信号途径中的细胞外信号调节激酶（extracellular regulated kinase，ERK）直接相互作用［6］，可能有利于信号分子定位于肌动蛋白细胞骨架。CLR结构域是由29个氨基酸组成的一个独立单元，以单个或多个拷贝串联重复而形成的一种结构方式，该结构是calponin蛋白家族的一个重要特征。目前认为，CLR具有稳固肌动蛋白细胞骨架的作用。h1CaP的羧基端有3个CLR，构成一个独立的肌动蛋白结合位点（actin binding site，ABS），称为ABS2。CLR非竞争性与肌动蛋白结合是其稳定肌动蛋白纤维的重要因素之一。此外，在h1CaP，CLR结构域的氨基端142-163个氨基酸区域也具有肌动蛋白结合功能，称为ABS1（actin binding site 1），但缺失ABS1的h1CaP仍然具有肌动蛋白结合活性［7］。

2 碱性调宁蛋白的生物学作用

20世纪90年代，h1CaP作为平滑肌分化的标记，研究者的研究主要集中在其结合肌动蛋白，抑制肌球蛋白ATP酶（myosin ATPase，简称ATP酶）方面。近年来，发现h1CaP可调节肌动蛋白细胞骨架的稳定性，认为h1CaP可作为重要的信号转导和整合分子，这种作用主要表现在控制基于肌动蛋白的细胞进程上。现在研究也表明h1CaP不仅作为平滑肌分化的可靠标记，还可预测肿瘤转移及患者的预后情况。

2.1 h1CaP参与平滑肌收缩的调控

平滑肌收缩的细胞内信息传递包括肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase，MLCK）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）两条途径.MLCK使肌球蛋白轻链上丝氨酸-19磷酸化，PKC使h1CaP和Caldes mon（另一种平滑肌调控蛋白）磷酸化，导致ATP酶活性增加，平滑肌收缩［8］。

h1CaP结合肌动蛋白的细肌丝，原肌球蛋白，钙调蛋白，抑制肌动蛋白活化的肌球蛋白Mg-ATPase活性和在固定化的肌球蛋白抑制Ca2+-依赖的肌动蛋白的移动性［1，9-12］，诱导F-肌动蛋白丝的构象改变和通过肌球蛋白减少横桥周期，增加最大力度的产生［13，14］。

2.2 参与细胞信号转导

调宁蛋白除了结合肌动蛋白外，还与很多蛋白配体结合，其中许多参与信号通路。h1CaP具有多个信号分子蛋白的结合域，如ERK，PKC等都可与它结合。这些信号传导通路与各种调节平滑肌细胞增殖的物质之间均存在着广泛的联系，h1CaP可能就在其中发挥着重要的作用。

h1CaP还可以被多种激酶磷酸化，有报告指出h1CaP是MAPK［15］，rho激酶［16］，PKC［17］多种激酶的底物，表明h1CaP除了调节平滑肌收缩，还可能通过细胞间的粘接、胞质分裂、细胞分化和增殖参与调节细胞信号转导通路。

2.3维持细胞骨架

h1CaP作为肌动蛋白细胞骨架结合蛋白，可通过与F-肌动蛋白相互作用来调节肌动蛋白细胞骨架重构。h1CaP主要有两个结构域：一是肌动蛋白结构域，能与肌动蛋白的羧基端结合，从而阻抑肌动蛋白对ATP酶的激活作用。二是钙调蛋白结合域，有人推测，h1CaP与钙调蛋白结合后.会逆转前者对ATP酶的抑制。

在体外，h1CaP结合磷脂，特别是带负电荷的如磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇［18］，连接不同类型细胞的质膜。当细胞受激动剂刺激时，h1CaP从细胞骨架向质膜易位［15］。

2.4参与血管病变及肿瘤的基因调节

h1CaP作为平滑肌细胞分化的标志物，除了调节平滑肌收缩之外，还能抑制细胞增生。过表达的h1CaP能抑制多种细胞的增生，而其表达降低或缺失则见于许多细胞增生性疾病。在许多种人类软组织和骨瘤中发现h1CaP蛋白和mRNA的表达，包括卡波西肉瘤，骨肉瘤，平滑肌肉瘤，骨的成纤维细胞瘤，滑膜肉瘤，恶性纤维细胞瘤，脂肪肉瘤，恶性神经鞘瘤，胃肠道基质瘤，副脊索瘤，以及唾液腺的肌上皮癌等，h1CaP在这些软组织和骨瘤中表达均比正常组织下调。

Negoro等［19］发现，动脉粥样硬化的早期（内膜无增生或轻度增生），大部分中层平滑肌细胞表达h1CaP，而处于增殖及向内膜迁移状态的平滑肌细胞不表达h1CaP。Takahashi等［20］利用兔颈动脉球囊损伤模型研究发现，血管损伤早期管壁中层平滑肌细胞h1CaP表达下调，同时伴有平滑肌细胞数量增加。Taniguchi等［21］在正常的小鼠和h1CaP缺陷小鼠中注射B16黑色素瘤细胞，在h1CaP缺陷小鼠的肺中发现更多的迁徙小瘤。这是因为h1CaP缺陷小鼠的血管没有完全发育成熟，非成熟的血管结构上脆弱，增加了癌细胞的血源性转移。h1CaP的缺失妨碍肿瘤新血管的形成及成熟，说明h1CaP参与血管病变的基因调节。

最近的研究表明攻击性的肿瘤扩散与周围间质细胞中h1CaP及α-平滑肌肌动蛋白的减少有关。在基因敲除实验中，h1CaP缺陷小鼠在一些组织中表现出形态学脆性，例如血管，子宫，腹膜，导致癌症细胞造血转移和腹膜散布［21］。经h1CaP治疗后，腹膜疾病被抑制，这表明h1CaP通过稳定腹膜防御肿瘤散布。

近年来，在平滑肌肉瘤，人类恶性黑素瘤，肝细胞癌，肾细胞癌，结肠癌等的血管中发现h1CaP表达下降。用h1CaP转染平滑肌细胞，成纤维细胞、纤维肉瘤HT1080细胞或平滑肌肉瘤细胞可抑制细胞增殖和致瘤性。在平滑肌肉瘤中（一种子宫平滑肌新生物），h1CaP表达减少，将h1CaP转染人类平滑肌肉瘤细胞系，发现h1CaP可抑制肿瘤细胞增殖［22］。黑素瘤细胞系的体外实验表明h1CaP表达水平升高可减少细胞的运动［23］。临床上肝细胞癌患者血管中h1CaP表达下降，促肿瘤血管成熟的h1CaP表达较高的肝细胞癌患者无瘤生存率明显更高，且肝细胞癌患者h1CaP的表达水平与疾病的预后相关，h1CaP蛋白表达的免疫组化分析可作为预测肝细胞癌患者肝切除后预后情况的新方法［24］。Islam等［25］在肾细胞癌的侵润性瘤，肉瘤等发现h1CaP表达较低，h1CaP维持血管完整性的功能不能较好的发挥，肾肿瘤血管中h1CaP的表达可作为肾细胞瘤的一种新的重要的病理学因子。Kaneko等［26］在v-src转化的大鼠成纤维细胞系SR-3Y1中发现，h1CaP主要通过减少血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达和血管发生，发挥肿瘤抑制因子的作用。Yanagisawa等［27］也发现结肠癌组织周围区域的血管h1CaP的表达随着肿瘤进展，淋巴结转移，血管浸润和复发显著降低。癌组织周围区域h1CaP的表达与VEGF呈负相关。Takeoka等［28］发现h1CaP基因通过稳定肌动蛋白丝，增强integrinα5β1系统的粘连抑制人类纤维肉瘤细胞的生长。此外，Suzuki等［29］的预试验，发现急性主动脉壁夹层形成病人的h1CaP水平比对照组高，可作为急性主动脉壁夹层形成的早期诊断标志。

大量增加的证据表明，h1CaP为调节癌细胞增殖和迁移的关键分子之一。在癌组织的血管中h1CaP的表达水平结合常规的肿瘤分类操作可作为癌症转移和患者预后有用的诊断标记。作为肿瘤抑制因子，h1CaP有用于基因治疗的巨大潜力，用h1CaP基因治疗癌症可能有效地抑制肿瘤的恶性扩散和保护宿主正常组织免受癌细胞浸润。

3 小结

碱性调宁蛋白是一种分化标志蛋白，在分化型平滑肌细胞中大量表达。它通过与肌动蛋白相结合，参与肌动蛋白细胞骨架重构，具有多种生物学功能。其表达改变与许多疾病的发生、发展密切相关，研究其生化特征及生化分子机理，能为预防和治疗平滑肌相关疾病及肿瘤，提供理论与实验基础。调宁蛋白行使肿瘤抑制因子的功能，将h1CaP互补DNA转移进未分化的肿瘤细胞具有潜在的治疗价值。

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