大鼠长期毒性试验质量控制探讨

许 迪，孔利佳，杜佐华，周顺长，叶明霞，熊美云

（1.华中科技大学同济医学院实验动物学部，武汉 430030；2.华中科技大学同济医学院药理学系，武汉 430030）

长期毒性试验可以观察连续反复给药时，实验动物出现的毒性反应、剂量与毒性效应的关系、主要毒性靶器官、毒性反应的性质和程度、毒性反应是否可逆等；还可观察在连续反复给药时，动物的耐受量、无毒反应剂量、毒性反应剂量及安全范围；并可了解毒性产生时间、达峰时间、持续时间及可能反复产生毒性反应的时间，有无迟发性毒性反应、有无蓄积毒性或耐受性等［1］。这充分说明长期毒性试验在临床前安全性评价中的重要地位，对于新药研究成功与否起举足轻重的作用。

长期毒性试验是临床前毒性评价的主要内容，是新药审评重点内容之一，是能否过渡到临床试用的主要依据。另外，它为临床安全用药的剂量设计提供参考依据，为临床毒副反应的监护及生理生化指标检测提供依据。因此，必须对长期毒性试验进行质量控制。主要包括试验开始前的试验设计质量控制、试验过程中的全程质量控制和试验结束后的资料整理和实验报告质量控制。

1 试验设计质量控制

试验设计是进行试验和统计分析的先决条件，是试验研究获得预期结果的重要保证。长期毒性试验往往需要参考急性毒性、一般药理、药代动力学研究和短期重复给药试验结果等进行合理设计。试验设计应由富有经验的药物毒理学家和药理学家负责把关。

1.1 剂量设置

剂量设置科学合理是试验成功的关键。剂量设计的方法有半数致死法、药代动力学法、最大耐受量法、拟用临床剂量法和等效剂量法等［1］。尤其是后三种方法，具有较高的参考价值，受到毒理学界的重视。不过，受试物各种各样，不可机械地照抄照搬，而应当是个案研究，对具体药物进行认真而细心的预试，才是摸准剂量的关键。正式试验常用三个剂量组和一个阴性对照组。高剂量组应有部分动物出现毒性反应或死亡（不超过20％），目的是为寻找毒性靶器官、毒性反应症状及拯救措施提供依据，中剂量组应使动物产生轻微的或中等程度的毒性反应，低剂量组应略高于药物对动物的有效剂量或临床试验用剂量而不出现任何观察指标的异常，目的是为寻找动物安全剂量范围，为临床剂量的设计做参考。

1.2 动物选择

SPF级封闭群Wistar或SD大鼠，5～7周龄，连续给药6个月时宜选用5周龄的大鼠，雌雄各半。动物的预订和SPF级动物实验室的消毒准备工作以及用于记录的统计表格要提前做好。

1.3 药品给药方式和周期

长期毒性试验给药途径，要尽量模拟人类实际接触药物的方式或途径，还要考虑将进行的其它毒性实验接触的途径相一致。主要途径包括灌胃（经口）给药、注射及皮肤接触。大鼠静脉注射时可用腹腔注射代替，肌肉注射或皮下注射时可变换注射部位。给药周期一般为临床给药周期的3～4倍［2］。3个月或3个月以上每周连续给药6d，以维持试验动物血浆中或体液内有较稳定的浓度水平，保持药物的生物学效应。

1.4 观察指标

按照《新药审批办法》，主要包括一般指标（体重、采食量、行为、死亡等）、血液学、血生化、脏器重量、大体解剖及毒理病理学检查。

1.5 数据处理及结果分析

2 实验过程质量控制

重点是严格遵循GLP（good laboratory practice）和SOP（standard operating procedure）要求进行试验，确保在不同地点、不同时间使用相同品种品系动物进行同样的动物试验能获得相同的实验结果［3］。

2.1 实验动物的质量控制

选用标准化的实验动物，从有生产许可证单位购进健康合格动物，观察适应一周，剔除体质过弱者和体重过大或过小者。饲养在有使用许可证单位提供的标准化实验设施内，保障设施的正常运转，提供实验动物所需要的舒适环境条件和足够的全价平衡营养，自由采食和饮水，每周更换两次垫料，保证实验动物的质量。对动物实验屏障设施进行制度化、规范化、素质化管理［4］，是确保动物实验顺利进行的重要保证。

2.2 实验动物的分组与编号

实验动物雌雄各半，分别按体重进行分层随机分组，随机化方法可选用随机数字表。每组20～30只，每笼单性别动物3～5只，每只动物均应编号，用3％苦味酸溶液标记；同时辅助以笼具编号。防止动物逃逸，确保实验结果的准确可靠。

2.3 药品的配制及给药

受试药必须符合临床试用质量标准，保证其稳定性。药品配制时，必须按试验设计方法认真进行，最好现配现用。多采用不等浓度等容量给药，给药时间要相对固定，由熟练的技术人员进行操作，减少系统误差。

2.4 日常观察记录

对实验动物的一般状况观察，虽是最古老最简单的毒性观测方法，却是最重要的基本观察内容之一。体重是反映机体整个情况最灵敏的指标，摄食量的变化在大多数情况下与体重的变化是一致的，但它出现得更早，反应更灵敏。因此每天称量动物的摄食量是非常必要的。每周称一次体重，作为计算下周给药量的依据。每天要认真观察动物的神经系统、消化系统及运动系统的反应，重视对感觉器官（眼、耳等）的观察。对于濒死和死亡动物，要及时进行剖检，主要脏器要取材，固定待检；一时有困难的，也可低温冻存，以免时间过久组织自溶。观察记录要及时、准确、全面、清楚，保存原始记录，以备日后核查之用。

2.5 血液学血象、血生化指标的检查

红细胞计数（RBC）、血红蛋白量（Hb）、白细胞计数和分类（WBC+DC）、血小板计数（BPC）是血液学检测的内容，天门冬氨酸氨基转换酶（AST）、丙氨酸氨基转换酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总胆固醇（T-CHO）、总胆红素（TBIL）、空腹血糖（GLU）、尿素氮（BUN）和肌酐（Crea）是血生化检测的内容。分别于给药3个月（13周）、6个月（26周）和停药后4周进行采血检测。检测中所需标本分别是全血和血清，采用血球自动分析仪和全自动生化分析仪进行测定。测定结果的客观性与动物全血样本是否凝血和血清样本是否溶血有关。重点是改进采血方法，提倡动物麻醉后摘眼球采血和腋动脉采血法［5］，及时送检。注意动物编号和采血管号的一一对应，做好记录，防止出错。

2.6 大体解剖及脏器称重、取材、固定待检等

首先要设计好批量动物尸检记录表格，包括动物种类和实验内容、活体及解剖时间、实验方法和分组、动物编号与病理编号、动物性别和体重、解剖所见、脏器重量、送检单位和送检者、解剖者和解剖日期。其次按照先对照组后实验组的顺序，采用急性失血法处死动物，做全身体表检查，然后按先腹腔后胸腔，再脑脊髓、外周神经、骨髓、体腔外特殊部位、注射部位、皮肤和肌肉等解剖取材，防止遗漏。其中胸腺、胰腺、肾上腺、卵巢、甲状腺、垂体、脊髓等腺体组织或微小组织应使用沙布或擦镜纸非挤压式包裹置于10％甲醛溶液中，防止包埋时混淆和丢失，保证病理学检查中组织样本数目的完整性［6］。怀疑毒性作用的靶器官要多取材，主要脏器和可疑损伤部位必须留有补做标本。取病变部位时应有足够的正常组织连带，有利于对比观察。要求样本均取自该组织的代表区。基本原则是分部位专人专责，专人称量，专人进行组织固定。

3 资料整理及实验报告的质量控制

长期毒性试验是费时长、参加人员多、消耗财力和物质大、操作繁琐复杂而又经不起重复的一个高难度研究工作，资料整理及实验报告的质量控制尤其重要。只有将药物作用于动物体后的临床表现、生化、代谢和形态学观察的结果综合起来，才能全面、客观、准确地评价药物的利害及价值。应由富有经验的药物毒理学家和药理学家负责把关。

3.1 数据处理和统计分析

主要包括动物体重及体重增长和食物利用率的变化、脏器重量与脏器系数、血液学血象与血生化指标等庞大的数据处理，可用excel中的数据分析功能进行分析处理。准确称量和测定是获得正确数据的关键，选择合适的统计分析方法至关重要。对于符合正态分布的数据资料，可用t检验或方差分析；如果是非正态分布，则用非参数统计分析法（秩和检验或Ridit分析），否则结果无实际意义［7］。对于统计学上P值的意义，一定要结合临床实际意义，才能得出客观、可靠、可信的结论［8］。

3.2 毒理病理学检查

病理学检查在长期毒性试验中占有重要地位，是评价药物毒性的重要依据，应由富有经验的病理学家负责。要重视器官重量指标的临床意义，器官重量异常在大多数情况下与病理变化是一致的。病理检查应分层次进行，先从宏观的一般肉眼观察，继而用光镜详细检查，必要时用电镜观察。病理变化最好半定量：无病理变化（一）为0分，可疑（±）为0.5分，轻度（+）为1分，中度（++）为2分，重度（+++）为3分。病理检查最好盲法检查，复核诊断，报告既要实事求是，如实描述，又要综合分析，慎重结论［9］。

3.3 资料整理及实验报告

对长期毒性试验的资料要仔细检查复核，结合文献资料及有关药物毒理学知识，实事求是地科学地分析总结。当出现毒性时，要尽可能阐明其毒性作用机理，这对最后评价有意义。撰写实验报告时，首页要写明试验指导者，课题负责人，病理学检查、血液生化指标测定、血液学指标测定及给药观察等负责人的姓名、职称；实验开始及结束日期、实验承担单位、研究室负责人和资料保存单位等。第二页书写试验摘要。第三页开始写正文、引言、材料与方法、结果等。要用设计合理的统计图、表清楚地显示给受试物前、给受试物期间和停给受试物后各项检测指标的测定值，以便了解受试物的剂量—毒性关系，统计处理应注明确切的P值大小。要客观地描述尸检及组织病理学检查结果，对各种异常现象可用半定量的方式表述，以便揭示其与剂量和时间的关系。

要圆满完成一个长期毒性试验，除了科学合理的实验设计外，全程的质量管理必不可少。首先要加强实验技术人员和动物饲养管理人员的上岗培训，提高其个人素质，增强其责任心，工作要认真负责，一丝不苟，持之以恒；其次要善待动物，不可粗暴对待或虐待动物，保障屏障系统的正常运转［5］，满足其维持生命、健康和舒适的需要；第三要严格执行GLP（good laboratory practice）和SOP（standard operating procedure），进行科学的人性化的管理，保证试验结果的真实性、完整性、可靠性和科学性；第四要对资料和报告执行检查复核制度，力求避免错误的发生，得到科学、正确的结果。

［1］吕秋军.新药药理学研究方法［M］.北京：化学工业出版社，2007：382-387.

［2］周立国.药物毒理学［M］.武汉：湖北科学技术出版社，2001：51-52.

［3］汤宏斌，孔利佳.实验动物学［M］.武汉：湖北人民出版社，2006：255.

［4］李学勇，靳洪涛，刘欣.实验动物屏障设施管理中的几个关键问题［J］.中国比较医学杂志，2008，18（1）：69-76.

［5］宗阿南，邹悦，任萍萍.实验动物质量检测中不同采血方法的比较［J］.中国比较医学杂志，2008，18（2）：74-75.

［6］叶明霞，孔利佳，许迪，等.药物毒理学检测中实验动物组织技术探讨［J］.实验动物科学，2008，25（5）：51-52.

［7］顾祖维.现代毒理学概论［M］.北京：化学工业出版社，2005：72-75.

［8］袁伯俊，王治乔.新药临床前安全性评价与实践［M］.北京：军事医学科学出版社，1997：61.

［9］袁伯俊，佘佳红，陆国才.创新药物非临床安全性研究应注意的若干问题［J］.毒理学杂志，2007，21（4）：277-278.