植酸酶活性测定方法的研究进展

陕西理工学院 陈 琛

植酸酶广泛存在于动物、植物和微生物中，能将植酸分解为肌醇和无机磷的一类磷酸单脂水解酶。文章介绍了植酸酶活性的测定方法，除了以前的传统方法外，近10多年植酸酶活性检测出现了许多新的方法，如近红外光谱法、琼脂平板法、酶联免疫吸附法、生物传感器法、高效液相色谱法等，这些新方法为植酸酶活性测定开辟了新的检测途径。

1 植酸酶活性测定方法的发展及意义

1.1 植酸酶活性测定方法的发展 植酸酶发现至今已经有100余年，植酸酶的研究已经取得了丰硕的成果。回顾植酸酶活性的测定方法：1925年Fiske-SubbaRow法，即钼黄法，因由Fiske和SubbaRow两人发现，所以早期钼黄法也叫Fiske-SubbaRow法；1943年Holman等发现了硫酸亚铁-钼蓝法，曾在国外许多国家发展为植酸酶测定的标准方法，至今还在许多研究中采用（Fu等，2008；Huang等，2008）；1981 年 Heinonen 和 Lahti建立了丙酮-磷钼酸铵法。植酸酶活性的测定方法除了这些传统的方法外，近10多年来随着科学技术和检测手段的提高，植酸酶活性分析检测及标准化方面出现了许多新的方法，并颁布了新的标准，如近红外光谱法（NIR）、琼脂平板法、酶联免疫吸附法（ELISA）、生物传感器法、反相高效液相色谱法（RP-HPLC）等。

1.2 植酸酶活性测定意义 植酸酶没有特定光吸收波和鉴定试剂，所以植酸酶的分析和活性测定比较困难（Lasztity等，1990）。动、植物植酸酶的提取、分离纯化，微生物植酸酶菌株的筛选，基因工程植酸酶表达产物等研究中都需要测定植酸酶活性。随着植酸酶在饲料中的广泛应用，饲料管理部门、饲料质检机构、科研部门以及生产企业均面临植酸酶定量测定的工作。目前存在着植酸酶酶活单位混乱、检测手段落后，测定结果误差大等一些问题，所以规范植酸酶酶活性定义和检测方法势在必行。

植酸酶活性的定义方法主要有以下几种：（1）酶活定义为每分钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放1 μmol的无机磷为一个酶活单位。（2）酶活定义为每分钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放1 nmol的无机磷为一个酶活单位。（3）酶活定义为每秒钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放1 nmol的无机磷为一个酶活单位。（4）酶活定义为每小时从一定浓度的植酸钠溶液中释放1 mg的无机磷为一个酶活单位。这四种定义中第一种的酶活单位最大，国外采用此种单位较多，我们称之为国际单位；第二种酶活单位是第一种的1000倍；第三种为第一种酶活单位的17倍；第四种与第一种酶活单位大小相近。

目前，植酸酶活性单位大多用FTU（fytase unit）表示。植酸酶样品在植酸钠浓度为5.0 mmol/L、温度37℃、pH值5.50的条件下，每分钟从植酸钠中释放1 μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。1994年该标准被AOAC（美国公定化学分析）在推荐方法中直接引用，作为统一的标准使用。国家标准GB/T18634-2002也采纳同样的定义。

2 植酸酶活性测定方法

2.1 分光光度测定法 分光光度法，也叫吸光光度法，是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括可见分光光度法、紫外分光光度法及红外光谱法等。

植酸酶酶活力测定的基本原理是利用酶水解植酸钠（肌醇六磷酸十二钠）形成无机磷，然后测定无机磷的释放量。常用底物植酸钠有两种型号：一种是Sigma p-3168，目前用p-0109替代，相对分子质量为923.8；另一种是Sigma p-8810，相对分子质量为660.03。根据国标要求，植酸钠应为Sigma p-3168。常用的方法有偏钒酸铵法、硫酸亚铁-钼蓝法、VC-钼蓝法、丙酮-磷钼酸铵法，其中前三种是基于可见分光光度法，丙酮-磷钼酸铵法是基于近紫外法测定。

2.1.1 钒-钼酸铵法 钒-钼酸铵法，又称钼黄法、偏钒酸铵法。该方法是利用植酸酶可以水解植酸磷释放出无机磷的原理。在酸性环境下，通过加入钼-钒试剂与水解释放出来的无机磷产生颜色反应，形成黄色的钒钼磷络合物，在415 nm波长下比色测定磷的含量，以标准植酸酶为参照物，间接计算被测样品中植酸酶的含量。Kim和Lei（2005）系统研究了该方法的影响因素，并对该方法进行了优化研究，增加了该方法的精确性和重复性。钼黄法因其标准曲线线性关系好，颜色稳定，干扰物质相对较少而成为测定低含量磷的经典方法。本法于1994年列入AOAC，我国在参考AOAC方法的基础上制定了 《饲用植酸酶活性的测定—分光光度法》（GB/T18634-2002，修订GB/T18634-2009）。

2.1.2 硫酸亚铁-钼蓝法 该方法利用植酸酶可以水解植酸磷释放无机磷的原理，通过加入三盐酸使水解反应停止，然后加入钼酸铵及FeSO4·7H2O的混合液使溶液显色，在720 nm波长下测定其吸收值，以标准酶为参照物，间接计算被测样品中植酸酶的含量，称该方法为FeSO4-钼蓝法。

2.1.3 VC-钼蓝法 该方法的原理是在酸性条件下，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应，当有还原剂存在时，磷钼酸立即变成蓝色的还原物质——钼蓝，形成的蓝色物质最大吸收峰在650～660 nm，再以标准磷溶液的吸光度及磷溶液浓度对应的酶活单位建立直线回归方程，测定无机磷的含量，最后以待测样品吸光度代入方程，计算出酶活性。

2.1.4 丙酮-磷钼酸铵法 丙酮-磷钼酸铵法，依据的原理是磷酸盐与过量的钼酸铵在酸性条件下混合后，可缓慢生成黄色磷钼酸铵，加入丙酮后将黄色物质抽提出来，在355 nm波长处测吸光度，灵敏度增加10倍。

评价一种测定方法重要的标准是精确度、灵敏度、稳定性、抗干扰能力、便宜和方便。不同的测定方法，各有优缺点。钒-钼酸铵法灵敏度最高，丙酮法稳定性最好，抗干扰能力较强，在测定饲料、发酵产物中植酸酶活性，采用丙酮-磷钼酸铵方法较好。黄遵锡（1999）研究结果也表明：从灵敏度来说，钒-钼酸铵法最高，VC-钼蓝法和FeSO4-钼蓝法次之，丙酮法最低，丙酮法的灵敏度与后两者相比相差较大，近1倍。但是，丙酮法较其他3种方法稳定性及抗干扰能力都较另外3种方法好。

2.1.5 近红外光谱法 近红外光谱是可见光与中红外光谱之间的一段谱区，其波长范围为750～2500 nm，近红外光谱分析是指利用近红外光谱区包含的物质信息，主要用于有机物质定性和定量分析的一种分析技术，具有对样品无破坏性、操作简便、分析迅速、测量信号可以远距离传输和分析等特点。Smith等（2001）利用近红外光谱技术，建立了鸡粪便中植酸磷的定量分析模型，对其进行了快速定量分析。杨海锋等（2008）通过广谱分析建立了校正模型，认为近红外光谱技术快速检测植酸酶酶活含量可行。Selle和Ravindran（2008）认为对近红外光谱在植酸酶活性分析中应用非常有前景。

2.2 琼脂平板法 Bae等（1999）建立并优化了琼脂平板法测定了微生物产植酸酶活性的方法，基于该方法，筛选了动物瘤胃内容物中产植酸酶厌氧细菌。具体方法如下：分离细菌，在含有植酸钠的培养基 （10%瘤胃液，0.25%葡萄糖，0.25%纤维二糖，0.3%淀粉，1.8%琼脂，1.0%植酸钠）上厌氧培养5 d后，移出培养皿置于需氧环境下，洗去培养基表面的细菌，培养皿中加入2%的氯化钴溶液，室温培养5 min，倾倒出氯化钴溶液；培养皿中再加入6.25%的钼酸铵-0.42%钒酸铵溶液，室温培养5 min，可产植酸酶的微生物在菌落周围可产生清晰的条带。

2.3 基于高效液相色谱测定法 Berry等（2009，2007，2005）人工合成了一个新的发色底物植酸的类似物（TInsP5），以TInsP5作为探针，建立一种快速、高效的测定土壤中植酸酶酶活性的反相高效液相色谱（RP-HPLC）-紫外（UV）检测方法。方法色谱柱为Sigma公司Supelcosil LC-18-T（150 mm×4.6 mm ID，3 μm）；流动相为甲醇-0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 6.0），比例由 19∶1 变化为11.5∶1，流速1.0 mL/min；检测波长为 226 nm。TInsP5与待测样品在45℃温孵80 min，然后煮沸20 min终止反应，离心用0.22 μm滤膜过滤，样品与甲醇-0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0）等体积混合用于HPLC分析。该方法快速、稳定、灵敏度高，适合体外植酸酶活性的评价研究。

2.4 酶联免疫吸附法 酶联免疫吸附法是以免疫反应为基础，将抗原抗体的特异性反应与酶底物的高效催化产物作用相结合的一种敏感性很高的检测技术。其具有特异性高、敏感性强、结果易于检测等特点。Zahradnik等（2004）将酶联免疫吸附法用于检测了黑曲霉、大豆、小麦、大米、饲料等11种样品中的植酸酶活性，检测灵敏度均达到40 pg/mL，批间变异系数＜10%。

2.5 生物传感器法 生物传感器是在生命科学和信息科学之间发展起来的一门交叉学科，对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器。最早的生物传感器发明于1962年，Clark和Lyon利用不同的物质与不同的酶层发生反应的工作原理，在传统的离子选择性电极上固定了具有生物功能选择的酶，从而构成了最早的生物传感器——酶电极。生物传感器是由固定化的生物敏感材料作识别元件（包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质）与适当的理化换能器（如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等等）及信号放大装置构成的分析工具或系统。生物传感器具有接受器与转换器的功能。Mak等（2004）把植酸酶生物传感器固定于丙酮酸氧化酶上用于测定植酸酶活性，制备的植酸酶生物传感器线性范围0.5～6.0 U/mL，检测限达到0.002 mmol。生物传感器法具有线性范围大、灵敏、操作简便、快速、结果准确、重复性好、抗干扰能力强等优点，适合于植酸酶活性检测.

3 总结及展望

综上所述，目前植酸酶的测定方法有基于分光光度测定的钼黄法、钼蓝法、近红外光谱法，以及近年来新建立的琼脂平板法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法和生物传感器法。分光光度测定法对设备要求相对较低，能在基层实验室和企业开展，目前发展的比较成熟，应用广泛；高效液相色谱法对设备要求相对较高，普通实验室不能开展；生物传感器法灵敏度高，但是作为一项新技术新方法未能成为广泛普及的常规分析方法；综合各种方法的优缺点，分光光度法中的钼黄法是目前科研机构、酶制剂企业等的常规分析方法。植酸酶在饲料工业、食品添加剂、医药工业等行业有着广泛的应用，相信随着科学技术的不断发展，新的植酸酶测定底物的发现，新技术和新方法研究的深入，简便、高灵敏度、低成本、稳定性和重复率高的植酸酶活性测定方法可能被开发并应用。

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