猪传染性胃肠炎疫苗的研究进展

吴 锋 黄毓茂

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是由冠状病毒科冠状病毒属猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引发的一种高度接触传染性的病毒性疾病。临床上主要以猪的严重呕吐、腹泻和脱水为特征，各年龄段的猪均可发病，尤其2周龄内的仔猪，死亡率可高达100%。自1946年该病在美国猪群中爆发以来，给全世界养猪业造成巨大的经济损失。据统计，1977年法国仅由于应付TGE的暴发就耗用了1000万美元的防治费用，现在许多欧洲国家接近100%的猪群还是TGE阳性，TGE同样给我国养猪业造成了严重的经济损失。因此该病的有效防控已成为世界养猪业关注的头等大事。目前，控制本病主要有两种方法：一是在少数发达国家，在有较高生产技术和严格的兽医卫生规范相配合的条件下，培育清净猪群，但是不能在多数国家推广；二是接种疫苗进行免疫预防。

人们自发现本病就开始研究免疫控制技术，大致经历了人工感染强毒、灭活苗、弱毒活疫苗和基因工程疫苗四个阶段。在很长一段时间里，许多国家都采用母猪人工感染强毒的方法，即在母猪分娩前2～3周对其进行口服感染，使其初乳中含有大量的分泌型IgA、IgG，这种免疫方法对仔猪能产生良好的免疫效果，但易使仔猪发病，有扩大蔓延TGE的潜在危险，因此现在很少应用。目前世界上主要采用弱毒苗、灭活苗或二者联合疫苗进行预防，即在怀孕母猪产前20～40d，经口、鼻和乳腺接种弱毒疫苗，使母猪产生包括lgA、lgG和IgM在内的乳汁抗体，或在仔猪出生后，用无病原性的弱毒疫苗口服免疫；生产上也用灭活疫苗，但其免疫剂量较大；虽然这种方法对仔猪能产生理想的保护效果，但也存在一定缺陷，如灭活苗安全性虽好，但免疫效果差，需添加佐剂，多次注射；而弱毒苗免疫原性虽优于灭活苗，但其毒性大，存在潜伏感染、排毒、散毒、毒力返祖等现象；同时，由于流行毒株毒力和生物学特性的变异性，常规疫苗往往不能抵抗自然流行病毒株的攻击。近年来，随着分子生物学和分子免疫学技术的发展，人们在广泛延用灭活苗或弱毒活苗等常规疫苗的同时，基因工程疫苗的研制也越来越多，并显示出良好的优越性，因此一种安全、高效的基因工程疫苗的开发已成为当务之急。

1.常规疫苗

1.1 灭活疫苗

目前国内外均有多种商业疫苗，曹军平等利用在某猪场分离到一株，TGEV地方毒株经冻融、纱布过滤提取滤液，加甲醛灭活，用汕乳剂乳化制成组织灭活苗，经实验室和野外试验，结果安全性可靠，保护率较高；贾华强通过制备TGE乳化和氢氧化铝吸附灭活细胞疫苗，进行临床四个猪场的实验发现仔猪存活率能达到80%以上。但灭活苗免疫妊娠母猪往往不能刺激机体产生有效的乳汁免疫，故临床上往往和弱毒苗一起使用，才可以产生较好的保护效果。

1.2 弱毒疫苗

弱毒疫苗近来没得到深入研究，还是局限于美国的TGE-Vac株、匈牙利的CKP株和日本的TO-163株等。Moxley等通过应用TGE弱毒活苗肌注免疫妊娠母猪，产生的母源抗体可以使仔猪对于TGE的耐过率明显高于灭活苗。国外的学者仍采用Ay-naud的方法将TGEV突变株188-SG致弱后分别通过口服、肌肉注射、眼结膜途径免疫妊娠母猪，从而使哺乳仔猪得到保护。我国的TGE弱毒株是在原代胎猪肾细胞上经165次传代致弱，其间又经5次克隆纯化筛选获得，采用的疫苗接种途径还是采用鼻粘膜和肌肉注射。王明等将TGE弱毒苗后海穴主动免疫母猪，结果对所产仔猪产生了很好保护效果，用小剂量TCE弱毒苗后海穴免疫3 d龄仔猪也取得了较好的免疫效果。但上述弱毒苗都必须经过多次免疫才能起到良好的免疫效果。弱毒苗能刺激粘膜免疫，肌肉注射产生抗体快、水平高，欧美现使用的疫苗主要是弱毒苗。

弱毒疫苗对预防该病的发生起到了重要的作用，但同样存在其他弱毒疫苗所存在的易返祖、有潜在感染危险等缺陷。

1．3 联苗

鉴于单一灭活苗和弱毒疫苗的缺陷，在临床上多采用联苗进行猪传染性胃肠炎等病毒性腹泻病的预防。姚新军等应用TGE-PED二联灭活苗，后海穴注射预防TGE，母猪发病率为3%，2周龄内哺乳仔猪发病率为0.7%，并且经治疗后无一头死亡。佟有恩等用TGE及PED克隆化弱毒株，以1∶1配比制成TGE-PED二联弱毒疫苗，免疫母猪和仔猪，被动免疫与主动免疫保护率分别为97.7%和98%，田间试验保护率为95%～98%，对紧急预防接种的防制效果更为明显。上海农科院畜牧兽医研究所钱永清等采用猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和轮状病毒细胞培养物制备了三联灭活疫苗。实验室免疫结果表明，育肥猪和妊娠母猪免疫后15d达到较高的免疫水平，免疫有效期超过6个月，妊娠母猪所产仔猪可获得高水平的被动免疫保护。试验场应用的结果表明，母猪保护率达98%，仔猪被动免疫保护率达93%。

2.基因工程疫苗

尽管常规疫苗在预防和控制TGE的过程中仍发挥着重要作用，但随着分子生物学技术和的飞速发展，基因工程疫苗以低成本、生产简单、存储方便等强劲的优势受到越来越多人的瞩目，各种TGEV基因工程疫苗的研究也得到了突飞猛进的发展。S糖蛋白是唯一能诱导中和抗体产生和提供免疫保护作用的结构蛋白，因此作为S蛋白分子基础的S基因就成为基因工程研究的重点。

2．1 亚单位疫苗

亚单位疫苗畔，含有特殊的高分子，它将保护性抗原基因导入细胞，高效表达，加以佐剂而成，能诱导机体产生抵抗病原体的免疫保护作用。由于猪传染性胃肠炎冠状病毒的S蛋白具有良好的免疫原性和在肠道内较强的抗降解能力，因此它成为发展哺乳动物肠道病原体口服疫苗的一个非常好的模型，Codet和Shoup等用杆状病毒为载体在昆虫细胞中表达S基因，表达产物与弗氏完全佐剂配制成疫苗，免疫35d龄路易斯鼠，能够产生高效价的中和抗体；12d后，鼠血清中和试验的效价达1∶2500；用表达的S糖蛋白作为弱毒苗免疫妊娠母猪后的加强免疫，可显著提高母猪血清和初乳的抗体水平，其对仔猪的保护率比弱毒苗两次免疫还高14%，但S蛋白亚单位苗单独免疫效果不佳。Tuboly等将TGEVS基因的7个片段和全长S基因的cDNA片段克隆在杆状病毒载体中表达。重组病毒免疫乳猪后，发现只有结构中包含抗原位点A的S糖蛋白才能产生高滴度的中和抗体。

2．2 基因缺失或突变疫苗

基因缺失或突变疫苗是通过人为的方法将与病原菌或病毒毒力相关的基因全部或部分删除，或发生突变而使其毒力减弱构建成的活疫苗，能够诱导机体产生较好的免疫保护力。Ballestems等尝试改变TGEV的S基因214位和655位2个碱基，制成重组疫苗，进行呼吸道和肠道组织感染，证明仅改变655位碱基，就可对呼吸道TGEV产生特异性反应，而219位碱基的改变则导致TGEV肠嗜性的丢失。进一步的研究发现，S基因219位碱基附近存在TGEV受体结合部位。Riffauh等研究发现缺失S基因的TGEV能够诱导α-干扰素分泌，由于缺失S基因，因此不会产生任何毒性，这为研制TGEV基因缺失疫苗奠定了一定的基础。

2．3 重组活载体疫苗

此类疫苗以某种非致病性病毒为载体携带并表达TGEV的保护性免疫抗原基因，即将一种病原免疫相关抗原整合到另一种载体基因组DNA的复制非必需片断中构成。目前，TGEV重组病毒疫苗的研究比较多，且证明疫苗效果很不错。SemMou等用减毒沙门氏菌为载体表达TGEV的S基因和S基因片段，由于表达的蛋白缺少糖基化依赖的构象免疫决定簇A，接种鼠、兔、猪后，均产生低水平的或者没有产生中和抗体，将表达的蛋白包被糖基化依赖的抗原决定簇(位点A，B)，接种动物则能够产生各种水平的中和抗体和保护力，杨恒”’等也通过减毒沙门氏菌为载体，成功构建了携带TGEVDNA疫苗的活载体口服疫苗，并显示出良好的免疫原性和安全性。Britton和Torres等将S基因插入到痘病毒和腺病毒载体中，然后用这两种重组的痘病毒和腺病毒免疫动物，均可诱发抗TGEVS蛋白的中和抗体。近年来，乳酸菌表达载体系统的研究已显示优越性，唐丽杰等以乳酸乳球菌为载体表达了TGEV的S基因片段，口服免疫BALB／c小鼠，能够产生明显的slgA抗体。重组活载体疫苗虽有一定的免疫保护作用，但造价比较高，不利于广泛的推广应用。

2．4 合成肽疫苗

合成肽疫苗是根据免疫抗原表位的氨基酸合成的抗原决定基小肽制作的疫苗。一般是从蛋白质的一级结构并结合单克隆抗体的分析，推导出蛋白质免疫主要抗原表位的氨基酸顺序，然后用基因工程技术或化学方法制备类似天然抗原决定基的小肽作为抗原。SemMou等将S蛋白的373～398片段氨基酸(含D抗原位点)组成的肽合成后克隆到大肠杆菌热不稳定毒索B亚基的(LT-B)3，端阅读框中，转染鼠伤寒沙门氏菌，用表达产物免疫兔子，产生抗TGEV的中和抗体。Anton等通过试验表明，将TGEV S糖蛋白在B细胞上的2种抗原决定部位(分别为C抗原决定部位363～371氨基酸序列和A抗原位点522～531位氨基酸区段)分别克隆到E.coli细胞表面CS31A纤维的CipG区进行表达，重组嵌合体免疫小鼠，诱导产生边缘性TGEV中和抗体反应，因此合成肽疫苗应用到生产实践完全是可行的。

2．5 转基因植物疫苗

转基因植物疫苗是通过植物基因工程技术与机体免疫机理相结合的原理，利用农杆菌或基因枪等技术，将免疫原性基因导入植物中，利用植物作为生物反应器大量表达有免疫原性的外源蛋白作为疫苗，或者把转基因植物直接加工饲喂动物，使其表达的抗原呈递到动物的肠道淋巴组织，被其表面特异受体识别，产生粘膜免疫和体液免疫反应。由于植物疫苗具有生产、贮运简单，无污染，无副作用等优点，因此利用植物来表达抗原生产疫苗越来越受关注。1998年，Gomez将TGEV的S基因克隆到花椰菜花叶病毒启动子下游，转化到拟南芥的种子中，成功地构建了TGEV转基因植物疫苗，用这种植物饲喂猪，结果产生了中和抗体和免疫保护作用。2000年，Gomez等将TGEV的S糖蛋白的N端结构域(含主要抗原编码蛋白)转入到马铃薯中制成转基因马铃薯，把这种马铃薯块茎直接喂给小鼠，小鼠体内产生了抗S蛋白的特异性血清抗体。Tuboty等也报道了植物表达，TGEVS蛋白免疫原性的研究。现在猪传染性胃肠炎冠状病毒的S蛋白已经被转入烟草、马铃薯、红豆花叶、玉米、拟南介等植物中，有的已经进行动物饲喂试验，并检测到抗体的产生。这些研究表明用植物表达TGEV的S蛋白具有经口免疫原性，TGEV的转基因植物可食用疫苗有广阔的发展前景。

3.展望

猪传染性胃肠炎是一种肠道传染病，病毒感染具有明显的肠嗜性，通过口服疫苗免疫，激发肠道粘膜免疫反应特别是sIgA的产生是预防该病较为理想的途径。也可通过应用辅助粘膜传递系统如免疫刺激复合物，生物可分解的微球体或感染性重组TGEV克隆来加强TGEV的免疫原性和减少致病性，进一步改进TGEV疫苗。就目前的研究发展来看，尽管常规疫苗有其固有的缺陷，但在市场上仍占有很大的比例，使用传统的方法加强疫苗的管理，更进一步研究免疫原性好的制苗菌(毒)株，改进生产工艺及自动控制培养抗原的方法，提高细胞培养技术，提高传统疫苗质量，仍是疫苗研究的一个重要方向。近年来，随着分子生物学、遗传学和免疫学的进展，基因工程实验技术的应用，使TGEV疫苗的研究和开发也得到迅猛发展，并在很多领域内取得进展和成果，为应用打下坚实的基础，生产实用的新一代疫苗的可能性已大大增加。截至目前，转基因植物疫苗和重组载体活疫苗都在研究之中，而核酸疫苗是基因疫苗研究的热点，乳酸杆菌疫苗由于其益生菌的特性也逐渐被重视起来。尽管基因工程疫苗已显示出良好的免疫原性，但大都处于起步阶段，还有许多的问题急待解决，例如采用的免疫方案、免疫机制研究、安全性等。随着研究的进一步发展，上述问题终将解决，TGEV基因工程活载体疫苗、TGE和猪流行性腹泻(PED)基因工程多价疫苗及转基因植物可食疫苗，必将有广阔的前景。我们可以预测，随着基因诊断、基因治疗和基因免疫等的研究的发展，人类将走向一个预防和治疗疾病的新纪元。