NK-92细胞的研究和应用进展①

罗 渊综述 段连宁审校 （中国人民解放军空军总医院临床航空医学实验室,北京 100142）

NK-92细胞的研究和应用进展①

罗 渊综述 段连宁审校 （中国人民解放军空军总医院临床航空医学实验室,北京 100142）

恶性肿瘤是危害人类生命与健康的较为严重的常见病、多发病。针对肿瘤的治疗方法有多种,其中,肿瘤生物治疗中较成熟的是免疫细胞治疗,尤以树突状细胞（DC细胞）和过继性细胞（CIK细胞、LAK细胞、ANK细胞）治疗效果为最好[1]。NK-92细胞是永生化的细胞系,能在体外有效杀伤许多肿瘤细胞系或从患者身上分离培养的原代肿瘤细胞,适宜用于过继免疫治疗。对其进行基因工程改造,可提高其杀伤活性、特异性和敏感性,有望使基因修饰过的NK-92细胞应用于临床治疗,为人类克服肿瘤提供新的途径。本文将对有望应用于过继性免疫治疗（AIT）的NK-92细胞的研究和应用进展作一综述。

1 NK-92细胞的生物学特点

NK-92细胞是Klingemann HG实验室于1992年从一名恶性非霍奇金淋巴瘤患者外周血分离并成功建系的大颗粒淋巴细胞。低浓度IL-2即可维持NK-92细胞的有效繁殖,而100 IU/ml的浓度可使其具有较强的细胞毒效应。若培养环境中缺少IL-2,NK-92细胞将在72小时内死亡。NK-92与NK细胞一样,识别靶细胞无MHC限制性,可以在无预先致敏的情况下杀伤肿瘤细胞。同时,还可以产生一系列的细胞因子,进而对机体的获得性免疫进行调节,但也与NK细胞有诸多不同。我们将从细胞表面的调节性受体和相关分子的表达入手,对比分析NK-92细胞和普通NK细胞的生物学特点[2,3]。

1.1 受体-配体介导的细胞杀伤 NK细胞对靶细胞的杀伤活性与其细胞表面的受体和靶细胞表面的配体密切相关,其中受体按功能不同可分为激活性受体（NKAR）、协同活化受体（co-stimulate receptors）和抑制性受体（NKIR）等。根据Karre[4]提出的“丢失自我假说”（Missing-self Hypothesis）,NK细胞主要清除那些丢失Ⅰ类主要组织相容性抗原（MHCⅠ类）的靶细胞,如病毒感染或恶性转化的细胞。NK细胞这种分辨自己和异己细胞的能力来源于NK细胞上的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIRs）对MHCⅠ类分子的识别和相互作用。通常,NK细胞至少表达一种抑制性KIR来识别自身正常细胞的MHCⅠ类分子,因为抑制性受体与配体的亲和力高于激活性受体的,且传递信号能力更强,从而维持对自身的免疫耐受。一旦细胞出现MHCⅠ类分子的表达下调,将导致NK抑制性信号下调,从而打破了NK细胞的“动态平衡”状态,相对地就提高了NK细胞的激活性信号,最终导致了NK对靶细胞的杀伤效应。

Maki等[3]通过 RT-PCR、抗体阻断实验、免疫印迹法和流式细胞术等方法对NK-92细胞表面的受体表达进行了研究,结果表明NK-92细胞具有典型的激活性NK细胞的免疫表型:CD2+、CD3-、CD4-、CD8-、CD56bright。KIR和NKG2受体家族都包含激活性和抑制性的成员,这主要取决于受体的跨膜区和胞浆区的结构特点,抑制性受体的胞浆区较长,含有免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）,而激活性受体的胞浆区较短,且不含ITIM结构,但其跨膜区往往带有含正电的氨基酸残基（赖氨酸、精氨酸等）,可以和一些跨膜区含带负电氨基酸的转接蛋白（DAP10、DAP12等）非共价结合而传递激活性信号[5]。大多数的KIR都克隆性地表达在NK细胞上,但NK-92细胞只表达KIR 2DL4这一种。NK细胞表达所有的NKG2A-E和NKG2H,而NK-92表达大部分的NKG2家族受体。在自然细胞毒受体方面,NK细胞表达经典的NKp46、NKp44和NKp30,而NK-92细胞虽然不表达NKp44,但还表达有 KIR 2DL4的同系物NKp49。此外,NK-92还表达大部分的协同活化受体和与信号传导相关的一些粘附分子,甚至还表达一些不存在于普通NK的激活性受体和相关分子,如CD3ζ链等。与此截然相反的是,NK-92细胞表达的抑制性受体大大少于NK细胞的,如它不表达大部分的KIR、NKR-P1A、KLRG1等,而且有的受体即使表达,却是极低水平的表达,如ILT-2等[3]。

众多研究表明,NK（包括NK-92）在细胞杀伤机制方面是以颗粒酶-穿孔素介导的细胞毒作用为主的,因为一旦阻止了穿孔素的聚合反应,用4小时乳酸脱氢酶释放实验就检测不到NK的杀伤活性[6]。而且,相对于新鲜分离或是经IL-2激活的NK细胞,NK-92表达有更高水平的颗粒酶A,这也和它的大颗粒淋巴细胞的形态学特点相一致。

1.2 抗体依赖的细胞毒效应 NK细胞可以通过表面的CD16,即低亲和力的免疫球蛋白Fc端受体（FcγRⅢα）,发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxity,ADCC）。NK-92细胞不表达CD16,因此,它不能介导ADCC效应,也就限制了其在和单抗药物联合使用的潜在价值[6]。不过,NK-92细胞完全去除了ADCC的影响,可将它作为研究NK细胞介导的直接杀伤机制的模型。

1.3 诱导靶细胞凋亡 NK细胞介导的凋亡包括两部分:一方面,通过活化caspase途径及不依赖caspase途径诱导细胞凋亡;另一方面,活化的NK细胞诱导CD95+、TNF受体阳性和TRAIL受体阳性的靶细胞通过内源酶的级联反应而发生凋亡。研究发现,NK-92细胞有FasL的mRNA转录,但是只有低蛋白水平的表达,当用淋巴细胞刺激物（佛波酯PMA和伊屋诺霉素Ionomycin）作用时可导致FasL的高水平表达。有意思的是,NK-92细胞同时也高表达Fas受体,也许这参与了细胞自身的负反馈调节机制,以去除过多的活化细胞。此外,NK-92细胞还表达有其它的TNF家族成员[7],诸如TNF-α、TWEAK、TRAIL等,表明NK-92细胞可以通过诱导表达相应受体的靶细胞凋亡来发挥强有力的杀伤作用。

2 NK-92细胞的应用进展

近年来,随着细胞克隆化技术的不断成熟,相继报道的NK细胞系有许多,但只有6种来自NK细胞瘤的NK细胞系是定性的,它们是经过单克隆化、可以永久生存的大颗粒淋巴细胞,含有嗜苯胺蓝颗粒和胚系TCR基因,具有NK 活性,如YT、NK-92、NKL、HANK-1、NK-YS、KHYG-1等。运用已建立的细胞系进行过继免疫治疗的主要优势在于,它们很容易在体外保存和扩增,避免了采用白细胞分离术的潜在副作用,而且还可以很方便地得到大量高纯度、性能均一的效应细胞。在这些细胞系中,尤以NK-92细胞最为突出,由于它几乎缺失所有的KIRs,同时高表达一系列的激活性受体,且含有丰富的穿孔素和颗粒酶,因此它不但有很强的杀细胞效应,而且具有很广的杀伤谱,使其成为临床细胞过继免疫治疗的有力候选者,它也是唯一经美国FDA批准进行临床Ⅰ/Ⅱ期研究的NK细胞系。目前,NK-92细胞的应用概况主要包括以下几个方面:

2.1 NK-92直接杀伤肿瘤细胞的初步应用 在NK-92细胞建立不久,Yan等[8]就对其在体外和体内对血液来源的肿瘤细胞的细胞毒效应进行了研究。通过铬51释放试验（CRA）,检测NK-92对46份来源于各种白血病患者的原代肿瘤细胞的杀伤效果,其中包括12例急性髓性白血病（AML）、7例T系急性淋巴细胞白血病（T-ALL）、14例B系急性淋巴细胞白血病（B-ALL）和13例慢性髓性白血病（CML）,结果表明,当效应细胞∶靶细胞（效靶比,E∶T）为9∶1时,共有24份（占52.2%）患者肿瘤细胞表现出对NK-92敏感或高度敏感,包括6例AML、7例T-ALL、5例B-ALL和6例CML。而对八种人类白血病细胞系（K562 、KG1 、HL60 、Raji、NALM6 、TALL-104 、CEM-S 和CEM-T）的杀伤实验表明,NK-92细胞对以上细胞系均具有很高的细胞毒效应。同批次的对照实验显示,18份来源于正常供者的骨髓造血细胞对NK-92介导的细胞杀伤均不敏感,表明NK-92不杀伤机体内正常的细胞。Yan等[8]也对NK-92在重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠体内的过继免疫治疗效果进行了研究,结果表明NK-92在活体内的细胞毒效应和活体外的具有很好的一致性,因此可根据体外实验对相应体内的过继免疫治疗效果进行预测评估。

Romanski等学者[9]进行了ALL对NK-92敏感性的机制研究,发现尽管NK-92缺失几乎所有的抑制性受体（除了KIR 2DL4）,但仍有一部分ALL对其不敏感。尽管部分ALL细胞表达非经典的MHCⅠ类分子HLA-G（KIR 2DL4的受体）,但并不介导其对NK-92的耐受,似乎与传统观点相悖。相反地,对NK敏感的T-ALL（MOLT-4）表达有中等水平的MHCⅠ类分子相关蛋白（M ICA/B）,它们是激活性受体NKG2D的配体,而对NK抵抗的B-ALL却不表达M ICA/B。说明ALL对NK-92的抵抗与其抑制性受体介导的机制关系不大,而与激活性受体介导的激活信号没有被充分激活有关,因此,为了提高ALL对NK细胞的敏感性,应将重点集中在如何激活NK细胞上,这与Reid等[10]的研究结果相一致。体外实验表明NK-92对许多黑素瘤细胞系的杀伤效果均强于LAK细胞,尤其是低效靶比时。在SCID小鼠体内进行的杀伤实验表明,静脉输注NK-92的荷瘤小鼠生存期增加了1.5～2.5倍,而若在输注肿瘤细胞前注射可自分泌IL-2的NK-92CI或NK-92MI可使小鼠存活期增加2.5～5倍左右。通过向小鼠背部皮下注射MEWO和WM 1341黑色素瘤细胞株后,可形成原位肿瘤、继发肿瘤和可迁移的癌细胞,通过输注NK-92可使肿瘤组织缩小30～90%,表明NK-92细胞有潜力成为过继免疫治疗的效应细胞。还有研究表明,NK-92可作为自体移植的“清除剂”,可有效减少甚至去除自体移植物中的恶性细胞,且不会对造血祖细胞产生副作用,从而大大提高自体移植的效果[11]。

2.2 对NK-92进行基因工程改造的应用 NK-92细胞的生长繁殖和杀细胞效应的有效发挥均依赖于IL-2的存在,若要利用NK-92进行过继免疫治疗,则需同时注射IL-2,而外源性IL-2可能会产生一些毒副作用,因此需对IL-2的剂量浓度进行精细计划。Konstantinidis等[12]通过基因修饰的方法,将IL-2基因转染进入NK-92细胞,但它不向细胞外分泌,而是合成后定位于细胞的内质网区,能够保持良好的自体活化,且其杀伤活性不受影响,从而既不需外源的IL-2也不向细胞外分泌IL-2,有效避免了IL-2可能产生的副作用。

一般来说,NK-92细胞对大部分血液来源的肿瘤细胞具有较强的杀伤能力,而对实体瘤来源的恶性细胞缺乏有效杀伤。如前所述,NK细胞对靶细胞的杀伤没有MHC限制性,且不需TCR或BCR的参与,属于非特异性杀伤。因此,为了使NK细胞能够更加特异地对肿瘤细胞进行杀伤,许多学者尝试着将针对肿瘤相关抗原的特异抗体表达在NK细胞表面上,从而使其对靶细胞的杀伤能力大大增强。Uherek等[13]将表达嵌合抗原受体的逆转录病毒载体转染NK-92细胞,筛选出的稳定株即可持续表达针对ErbB2原癌基因产物（HER2/neu）的嵌合分子,该嵌合分子由从N端到C端依次为免疫球蛋白重链信号肽、ErbB2抗体的单链可变区片段（scFv）、CD8α绞链区 、CD3ζ（zeta）链 。杀伤实验表明,对于ErbB2表达阳性的恶性细胞（如MDA-MB453）,改造后的NK-92细胞具有很强的杀伤效应,而初始NK-92不能杀伤;而对于ErbB2表达阴性的肿瘤细胞（如K562）,则改造前后的杀伤活性变化不大。进一步的实验表明,改造后的NK-92细胞对不同的上皮源性恶性细胞系的杀伤能力与其表达ErbB2的水平相一致;而且即使在较低的效靶比（3∶1）时,高表达ErbB2的肿瘤细胞（如SKBR3）仍能被迅速诱导凋亡。除了肿瘤细胞系外,还对来源于人乳腺癌的原代恶性肿瘤细胞（ErbB2+）进行了实验,结果表明改造后的NK-92具有很强的杀伤能力,而初始NK-92则几乎不能杀伤。此外,作者还利用CD-1裸鼠进行了活体内实验,结果表明改造后的NK-92细胞可明显抑制肿瘤的生长。Muller等[14]也进行了相关的研究,他们将NK-92改造成表达CD20特异的嵌合抗原受体,从而使原先对NK-92不敏感的滤泡性淋巴瘤和急性B前体细胞白血病逆转成对改造的NK-92高度敏感,而且与肿瘤细胞表面的CD20表达量正相关。由此可见,通过嵌合受体改造,可以逆转肿瘤细胞对免疫效应细胞的耐受性,从而为杀伤肿瘤并最终治愈肿瘤提供了一条有效途径。

2.3 NK-92在临床上的初步应用 由于NK-92细胞的诸多优点,它是第一个进入临床用于治疗晚期癌症的NK细胞系。Tam等[15]的研究表明,当γ射线的照射剂量为500 cGy时,可以在阻止NK-92繁殖分裂的同时保持其高杀伤活性,即使照射剂量提高到1 000 cGy,仍可在48小时内保持其杀伤活性。Tonn等[16]对NK-92应用于临床可能产生的问题做了全面的研究,确定了GMP条件下大规模扩增培养NK-92细胞的最佳培养条件和操作程序,并对7名晚期癌症患者进行了临床Ⅰ期实验,每名患者输注两次NK-92 细胞,剂量不一（109、3×109、5×109等）,前后隔48小时,结果显示个别患者出现低热、背痛等不适反应,但总体来说每名患者输注3×109/m2γ射线照射过的NK-92都是安全的,至于NK-92在晚期癌症中的功效,还有待进一步的深入实验。同时,为了研究受者是否会排斥输注的NK-92细胞,Tonn T分别进行了微量淋巴毒实验和T淋巴细胞活化标志CD69的检测,结果表明输注NK-92细胞不会引起受者的排斥反应,不过这也可能是由于受者已处于免疫缺陷状态引起的,还有待后续深入研究。此外,美国FDA已经批准进行了一些NK-92的临床治疗恶性黑色素瘤和肾癌的研究,但都还没有取得最终的结果,而且样本量都比较小,还有待于进一步的完善和验证。

3 小结及前景展望

NK-92细胞具有类似于激活性NK细胞的特点。细胞表面几乎缺失所有的识别并结合HLA-Ⅰ类分子的KIRs（只表达KIR 2DL4）,同时表达有丰富的激活性受体、协同活化受体、诱导凋亡的分子和粘附相关分子等,因此NK-92具有很高的杀细胞活性和很广的靶细胞谱,适宜用于过继免疫治疗。对NK-92细胞进行基因工程改造,可大大提高其杀伤活性、特异性和敏感性。NK-92过继免疫治疗临床Ⅰ/Ⅱ期试验,积累了有价值的实验数据和经验。相信,随着肿瘤相关抗原的不断发现、肿瘤逃逸机体免疫系统杀伤机制的逐渐明确、NK细胞受体配体作用机制的不断深入和安全高效的基因转染技术的出现[17],有望使NK-92细胞尽早应用于临床治疗,为克服肿瘤提供新的途径。

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[收稿2009-07-11 修回2009-08-06]

（编辑 倪 鹏）

R392

A

1000-484X（2010）01-0085-04

①本文受国家自然科学基金项目（No.30873014）资助

罗 渊（1982年-）,男,硕士;

及指导教师:段连宁（1964年-）,男,博士,主任医师,硕士生导师,主要从事造血干细胞移植治疗恶性血液病的临床与基础研究,E-mail:duanln@tom.com。