人脐带间充质干细胞的特征及其临床应用前景

徐若男 施 明 王福生 (解放军第三○二医院生物治疗研究中心,北京100039)

1966年间充质干细胞首先由Friedenstein[1]从骨髓中发现,传统理论认为这群细胞在特定诱导条件下可向中胚层细胞即骨、软骨和脂肪细胞分化。然而越来越多的研究发现间充质干细胞具有向内、中、外三个胚层包括肌健、韧带、肝细胞、心肌细胞和骨髓基质等分化发育的潜能[2]。骨髓来源的间充质干细胞易于培养、可大量扩增、遗传背景相对稳定且多向分化特性不会受到影响[3],临床上常被用于细胞(或组织)替代治疗。但成人骨髓源间充质干细胞数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降,且供者间充质干细胞的采集须行骨髓穿刺术,由于疾病的原因,病人常有感染、体质较弱等因素也限制了自体骨髓MSC移植的应用。因此寻找新的MSC来源是目前国内外干细胞研究的热点。脐带来源广泛,便于取材,对供者无不利影响,无伦理道德问题的限制,且细胞增殖、分化能力较强,适合体外大规模培养。因此,脐带MSC(Umbilical Cord-MSC)有望成为骨髓MSC的理想替代来源。正确分离脐带间充质干细胞、鉴定其表型和功能、研究在疾病治疗中的具体作用机制以及与其它免疫细胞之间的相互关系,对于深入认识脐带间充质干细胞的特性、加速临床应用进展具有非常重要的意义。ton's胶质和血管周围组织中分离培养出了MSC,并建立了脐带间充质干细胞的分离培养方法。常用的脐带间充质干细胞体外分离方法主要包括植块法和酶解法。依据选取消化酶的种类又可分为胶原酶消化、胰酶消化和两种酶顺序消化法。其中植块法对细胞直接损伤小,原代培养细胞纯度高,简单、经济,但所需培养时间长。酶解法获得细胞数量大,培养时间短,但细胞纯度略低,同时异源蛋白的引入会增加临床应用过程中发生过敏反应的可能性。

就取材方便及对供者的影响而言,脐血和脐带是较理想的MSC来源。关于脐血MSC的报道存在较多争议,主要是其多系分化潜能较弱,会出现间充质干细胞表面标志SH-2、SH-3和SH-4表达缺失的现象。脐血分离的要求也较为严格,例如分离取材时间不得大于15个小时,体积不得少于33ml等,而细胞分离效果只为1/100万,且分离成功率也仅为60%。同时脐血MSC的分离会损失脐血中造血干细胞。而脐带来源广泛,不影响胎儿脐带血的保存,无道德伦理问题的限制,易于体外大量扩增,培养成功率高达100%。并且脐带可望作为自体MSC来源和脐血共同移植,以提高脐血移植成功率。因此,脐带MSC有望成为骨髓MSC的理想替代来源。

1 脐带间充质干细胞的采集和优势

目前间充质干细胞的主要来源为成人骨髓,但成人骨髓源间充质干细胞数量及增殖分化潜能随年龄的增大而逐渐减弱,且病毒感染率较高、来源受到限制。因此寻找新的MSC来源显得尤为重要。随着间充质干细胞研究的不断深入,已可从脐带、脐带血、骨骼肌细胞、脂肪、滑膜和肝脏等多种组织中分离得到间充质干细胞。2000年,Rrices[4]首次报道了脐带血中可以分离培养出间充质干细胞,随后Romanov等又分别从脐静脉内皮和内皮下、脐带Whar-

2 脐带间充质干细胞的鉴定及功能研究

研究显示MSC具有异质性,其表达的表面标志抗原较为复杂。如骨髓间充质干细胞可表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志,主要包括:①粘附分子 ,如 CD166、CD54、CD102、CD44、CD106 等;②生长因子和细胞因子受体,如白介素1受体(IL-1R)、IL-3R、IL-4R、IL-6R、IL-7R、干扰素受体 、肿瘤坏死因子α等;③整合素家族成员,包括 CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104 等;④ 其它如 CD90、CD105等。许多研究表明不同组织来源的MSC同时又具有相似的免疫表型特征[5],表现为SH2(CD105)、SH3(CD73)、SH4 、CD166 、CD13 、CD29 、CD44等粘附分子阳性,不表达造血和内皮标记,如CD34、CD31和 CD45等。表达HLA-I,不表达HLA-DR,不表达协同刺激分子CD80、CD86和CD40。

胎儿组织来源的MSC分化程度更低,还可以表达其它动物如马源的SSEA-1、SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81和猪源的 Nanog,Oct-4、Sox-2、Rex-1 等分子 ,其比成人组织来源MSC具有更高的增殖能力和较弱的免疫调控能力。但与胚胎干细胞比较体外传代后基因遗传稳定性更强。骨髓MSC在体外培养8～15代或倍增25～40代后,增长停滞,开始分化过程,出现细胞变大、紧密连接消失、增殖速度减慢等现象,同时细胞表型和功能分析显示细胞出现衰老现象。脐带MSC拥有很多骨髓MSC的特点,例如成纤维样形态、免疫表型、细胞周期状态、以及脂肪和成骨分化潜能和促进造血的功能。但脐带MSC形成CFU-F的能力要显著优于骨髓MSC,增殖能力更强,脂肪分化能力更弱。此外,脐带MSC细胞因子分泌谱除了表达骨髓MSC相关细胞因子外,还表达GM-CSF和G-CSF,并特异性表达人白细胞分化抗原HLA-G和神经胶质来源的神经营养因子GDNF[6]。

3 脐带间充质干细胞在疾病治疗中的作用及相关机制

间充质干细胞因其多潜能和可扩增性对再生医学产生了不可估量的影响。在细胞治疗、组织工程以及再生医学领域内,间充质干细胞作为种子细胞可应用于修复/替代受伤或病变的多种组织器官,从而为目前一些无法有效治愈的重大疾病如脊髓受伤、多发性硬化(MS)、老年性痴呆、帕金森氏症等提供了崭新的治疗方案。

除了间充质干细胞的可塑性外,MSC的免疫调节、免疫抑制功能尤其值得关注。其中骨髓MSC通过自我更新、多向分化和分泌多种效应因子如透明质酸等构建起稳定的造血微环境,在造血干细胞的生长、增殖、分化中发挥重要作用[7]。实验性脑脊髓炎的动物试验证明,MSC可以移入中枢神经系统,通过发挥免疫抑制功能,保护正常神经元的功能。对于众多神经系统疾病而言,MSC发挥抗凋亡、抗炎症的功能主要是招募、诱导局部组织中的前体细胞向神经元的分化,而并不依赖MSC自身向神经元的转化。骨髓MSC治疗缺血性心脏病(如心肌梗塞)、脑梗塞和脊髓损伤的研究证实,MSC能够改善心脏和脑组织功能,主要机制是通过分泌SDF-1和VEGF等局部细胞因子,诱导微血管的生成,改善缺血组织微环境。体外试验证实MSC能被诱导为心肌细胞,并表达肌钙蛋白Ⅰ和肌间蛋白[8]。在链脲霉素诱导的小鼠糖尿病模型中,MSC可以加速胰岛再生,促进肾小球肾炎的恢复。当MSC和骨髓细胞共同移植时,MSC可以有效抑制胰岛β细胞特异性T细胞增殖,通过促进内源性胰岛β细胞再生,恢复胰岛功能,维持血糖水平稳定[9]。

脐带MSC的临床研究相对滞后,但目前的研究证实脐带MSC作为滋养层细胞对胚胎干细胞的增殖分化同样起到支撑作用,其分泌的神经营养因子GDNF有利于维持胚胎干细胞的未分化状态。在条件性的神经元培养基内脐带MSC可以被诱导为神经细胞,并表达神经元β-微管蛋白和星型胶质细胞蛋白GFAP[10]。Campard等[11]用肝细胞生长因子通过两步法在体外有效地诱导出脐带MSC向肝细胞的分化,被诱导的细胞在形态和分子标记物上都具有肝细胞特征。通过白蛋白和尿素分泌、糖元贮积、低密度脂蛋白摄取和细胞色素P450活化研究,进一步证明了人的脐带间充质干细胞能够被分化诱导成有功能的肝细胞。作为稳定、有效的基因载体,脐带MSC介导的干扰素β靶向基因治疗动物试验显示,脐带MSC能够携带靶基因定向进入癌症组织,有效减少实体肿瘤体积[12]。

English等[13]对MSC抑制免疫排斥反应的机制研究证实,MSC可以从多层次对免疫反应进行调控。对T细胞、B细胞、DC细胞、NK细胞等的激活和增殖具有抑制作用。表现在:影响DC细胞的移位、成熟,降低T细胞对抗原的识别能力,与NK细胞表面的特定受体结合,诱导NK细胞的免疫耐受等。MSC发挥抗凋亡效应与抑制炎性因子IL-1β、TNF-α的产生密切相关。MSC进入机体优势分布于受损部位,促进其功能恢复。但更多的机制表明MSC并没有直接参与组织再生,而是为其它细胞的增殖分化提供良好的微环境。因此进入机体的间充质干细胞是否能定向进入机体受损部位、正常分化为组织细胞?是否会发生与器官移植相似的急性免疫排斥反应等问题就显得尤为重要。

4 结语及展望

近年来,细胞(或组织)替代治疗和基因治疗是医学领域乃至整个生命科学领域中的研究热点和前沿,为人类征服多种疾病提供了希望。骨髓间充质干细胞相对容易分离培养、体外可大量扩增、遗传背景相对稳定、体内植入反应弱,易于接受外源基因的导入和表达,而被认为是一种较为理想的组织工程和基因载体细胞。脐带间充质干细胞的研究是传统骨髓间充质干细胞的新生力量,与传统的骨髓源MSC比较,脐带源MSC的绝大多数生物学特征与骨髓源MSC相似,但在增殖能力、CFU-F频率、CD106、HLA-Ⅰ表达和神经诱导分化能力等方面甚至要优于骨髓源MSC。同时脐带来源广泛,便于取材,对供者无不利影响,不影响脐带造血干细胞的保存,无道德伦理问题的限制。因此,作为一种新型种子细胞,脐带间充质干细胞的应用具有更广阔的前景。

依据MSC的移植来源不同,有自体和异体之分。临床上的某些危急时刻异体MSC更省事、省力。而某些亚急性状态下,自体MSC更安全。就MSC的安全性而言,即使来源于自身免疫系统疾病患者的MSC也具有正常的表型和分子标记,体内环境下MSC抑制T细胞过度增殖功能的缺乏,并非是MSC自身免疫调节功能的异常,而是骨髓内微环境的紊乱。因此MSC发挥免疫功能的完整性更具有保证。

但目前间充质干细胞的研究仍存在迫切需要解决的问题。例如因组织来源、试剂使用、培养条件、血清使用、添加细胞因子种类、细胞培养密度等不同,造成不同实验室的同一组织来源干细胞的细胞表型、起始细胞异质性、分化能力、增殖能力、长期培养后的细胞功能等存在较大差异,直接影响了间充质干细胞的应用[14]。因此,急需将间充质干细胞的取材、分离、培养和鉴定方法等标准化,研发新的试剂、鉴定表型标志和建立统一的原始细胞质控标准,从而加速间充质干细胞的研究。另外MSC的肿瘤原性也值得关注,一方面MSC通过转化为肿瘤基质促进肿瘤生长;另一方面,MSC的免疫抑制功能也是其促肿瘤效应的必要条件。但最新的“touch and go”理论认为MSC进入机体后迅速移位于受损组织,随后又很快被压力诱导的“治疗因子”所清除,因此应用中安全性较高。综上所述,脐带源MSC作为间充质干细胞的新生代表,在进一步完善其作用机制和临床研究的基础上,会拥有更为广泛的应用前景。

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