华支睾吸虫与肝/胆癌发病机制

程艳洁(综述),姚丽君(审校)

无论是机体自然发生的肿瘤,还是条件诱发的肿瘤,其病因有多因素、多步骤、多阶段的特点,是一个漫长复杂的作用过程,寄生虫感染致瘤也不例外,是多因素多阶段发展的结果〔1〕。胆管癌也是在丙型肝炎病毒HCV感染、胆石症等基础上合并多种因素如癌症相关基因 P16、环氧酶-2〔2〕作用、多阶段〔3〕发展的结果。流行病学调查华支睾吸虫流行疫区(四川、珠江三角洲及东南亚地区),发现胆管癌发生率较高,推测肝吸虫感染可能是其病因之一,而且在华支睾吸虫流行区,胆管癌变在肝细胞癌的演变中也起着很重要的作用〔4〕。

1 华支睾吸虫致癌假说及理论依据

流行病学调查表明华支睾吸虫终宿主猫、狗、猪等有不同的携带率〔5〕,而人感染后根据个体的情况将有不同的表现。早期或轻度感染可无明显病理变化,感染较重时,胆管可发生囊状或圆柱状扩张,管壁增厚,周围有纤维组织增生。严重感染时,管腔内充满华支睾吸虫和淤积的胆汁,镜检可见胆管上皮细胞增生重叠,形成腺瘤样组织,向腔内突起,管壁内凹凸不平,并可有憩室形成。慢性感染可有大量的结缔纤维组织增生,附近的肝实质可见明显萎缩胆道分泌糖蛋白的增多并附着于虫卵表面作为结石核心起支架和粘附剂作用促进胆红素钙的沉积最后导致色素类结石(即肝内多发性结石)的出现〔6〕。严重感染的病例,肝细胞可有变性坏死。华支睾吸虫在人体胆管内最终能否引起癌变长期有争议,但近年动物研究表明,在华支睾吸虫感染而引起的上皮腺瘤样增生的基础上可以出现癌变,最后并发肝胆管癌〔7〕。

通过了解自然状态下感染华支睾吸虫的218只猫现状及该病对肝脏/胆管及生理生化指标的影响,结果发现8只猫的肝脏表面有明显的黄豆粒大小的肿瘤;205只猫肝脏质地变硬,结缔组织增生;25只猫肝脓肿,肝色较黄,小叶结构模糊;118只猫胆管内上皮细胞增生,血清丙氨酸氨基转移酶显著升高(P＜0.05),华支睾吸虫对肝脏/胆管及胆囊造成了严重伤害,很可能是肝癌/胆管癌的诱因之一。华支睾吸虫对自然感染动物模型猫肝脏/胆管及生理生化指标的影响通过解剖及病理切片发现华支睾吸虫病对肝脏/胆管和胆囊的损伤非常严重,除了上皮增生外,还发现有些组织已经结缔化,并有癌变的趋势。近年来也有学者推测,华支睾吸虫和胆管癌/肝癌有密切关系的假说〔8〕。有关华支睾吸虫诱发肝癌/胆管癌的机理,目前还没有定论,可能是华支睾吸虫在长期的进化过程中获得了与宿主相近的一些功能基因,这些基因具有调控细胞生长发育的功能,它们作用于胆管上皮细胞和肝细胞,表现出与促癌或抑癌基因类似的调节宿主细胞生长发育的活性,从而诱导或调节胆管上皮细胞和肝细胞的恶性转化〔9〕,这些假说还有待于进一步深入研究探讨。在研究华支睾吸虫病与原发性肝/胆管癌关系时,利用华支睾吸虫诱发肝胆管癌成功,虽然没有后人重复,但从自然感染的猫模型上进一步说明了华支睾吸虫与肝癌/胆管癌的密切关系,一些尸检及病例报道从另一方面证实了这种假说。

朱师晦〔10〕等(1982)报道经尸检证实的8例胆管癌中有华支睾吸虫感染,而108例肝细胞癌中有华支睾吸虫感染。其诱因是因为虫体和虫卵的机械刺激、代谢产物的作用、所致胆管上皮细胞呈腺瘤样增生,以致间变成癌,这一病理变化在动物实验体内也得到证实〔11〕。丘福禧〔12〕等报道广州市华支睾吸虫共存病中,有本虫感染的10480例中患原发性肝癌者为0.35%;而对照组87 639例中患肝癌者仅有0.05%。侯宝璋报道香港200例原发性肝癌中有华支睾吸虫感染者46例(23%),进一步证实华支睾吸虫与原发性肝癌有密切关系的假说。

泰国Thamavit〔13〕等早在 20世纪80年代的三次实验报告中证实华支睾吸虫感染基础上药物干预更易诱发癌变。国外 Koo〔14〕报道3例少见的粘液表皮样胆管癌同时存在肝吸虫,指出该类胆管癌的发生可能与肝吸虫病有关。韩国学者LeeWJ〔15〕、美国 Thuluvath〔16〕也研究认为肝吸虫是胆管癌的重要诱因,国内王友顺报道肝吸虫病合并胆管癌发生率明显高于非感染人群〔17〕。

2 华支睾吸虫感染引起的肝/胆病理生理学变化

原发性肝癌/胆管癌的病因和机制尚未完全肯定,可能与病毒感染等多种因素综合作用相关,我国胆管癌多有结石病变基础。但就华支睾吸虫感染后作用而言其主要可能与长期刺激胆管上皮增生而产生胆管细胞癌。研究表明,华支睾吸虫寄生在胆管内,虫体及代谢物,感染等引起胆管机械和化学刺激,诱发胆管上皮增生和腺瘤的发生。肝吸虫感染后诱发胆管癌是一个长期慢性的病程,从胆道肝吸虫感染到胆管癌确诊,平均潜伏期长达15年,其作用机制可能与提高机体对致癌因素的敏感阈有关,Tesana〔18〕发现叙利亚金田鼠经麝猫后睾吸虫注射后,诱变剂亚剂量作用就可癌变,可能是吸虫的初级抗原诱发机体免疫反应而加速了肿瘤的生长。华支睾成虫主要寄生终宿主肝内二级以上分支胆管内,成虫的机械刺激和代谢产物是致病主要因素。人体感染后由于华支睾吸虫抗原的刺激,机体免疫系统产生特异性IgG作用于肝内胆管的同时也使邻近肝细胞发生脂质过氧化反应,不断产生脂质过氧化物(Lipoxygenase LPO),脂质过氧化物LPO的分解产物引起肝细胞损伤,导致肝功能改变,随着肝细胞的损伤,外周血中LPO的含量逐渐增多,超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性降低,肝清除过氧化氢H2O2的能力下降,加重了脂质过氧化作用,形成恶性循环。

3 华支睾吸虫感染引起免疫病理及刺激分泌细胞因子的作用

寄生虫与宿主之间共进化过程逐渐建立二者之间免疫学平衡,寄生虫的致病性与宿主的易感性和抵抗力有密切的关系,寄生虫的多样性导致免疫应答的多样性,虫体感染激活Th1同时也激活Th2,而后者产生的细胞因子IL-4、IL-5及 IL-6可抑制IFN激活巨噬细胞的免疫活性,加重感染扩散,加重机体损害。吸虫感染中,细胞因子IL-2、IL-5参与介导结节形成和纤维化,细胞因子可在局部介导免疫病理损害,过量的TNF、IL-1对血管内皮也造成损害,促进内皮细胞粘附,使感染恶化,机体损害加重。同时INF-γ可导致NO产生,引起另一途径机体损害。吸虫感染后持续的幼虫移行,可引起持续的高度嗜酸性粒细胞反应,短暂移行可引起短暂的嗜酸性粒细胞增多,而慢性嗜酸性粒细胞增多可引起宿主持续的组织炎症反应。而这些免疫病理反应将可能参与癌变途径,分泌的细胞因子也可能参与癌变机制的调节。

4 多种因素结合的复杂致癌机制

在动物实验中,华支睾吸虫感染作为肝胆致癌的机制可能有两个方面:①致癌物质投予时已有寄生虫所致细胞坏死以及细胞增生,后者起了启动作用。致癌物质使细胞DNA发生损伤而发生癌的机制中,只有DNA损伤固定于细胞内才能发生基因变异、重组和转位而引起癌基因被激活。在DNA损伤固定中,细胞增生是绝对必要的。由于生理条件下几乎无肝细胞增生,但采取适当方法,例如肝部分切除或予致肝坏死物质以诱发肝再生,即在发生肝细胞增生的条件下投予哪怕是小量的致癌物质,也可以发挥启动作用。②寄生虫引起慢性细胞坏死和再生,从而对肿瘤发生具有促进作用。慢性持续的炎症坏死反应以及继之而来的细胞增生,也可能非特异性地对肝癌发生起促进作用〔19〕。华支睾吸虫感染相关性胆管癌的发病机制是一个复杂的过程,包括多种可能机制,根据已有的证据可能的发病机理概括如下:

4.1 胆管上皮细胞的超常增生和长期暴露于致癌物中 华支睾吸虫成虫主要寄生在肝胆管内,虫体和虫卵长期慢性机械刺激及代谢产物作用引起胆管上皮细胞脱落,胆管壁及周围组织淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润,胆管上皮腺瘤样增生,管壁结缔组织增生。增生的细胞对致癌物敏感,在活跃的细胞增殖过程中,致癌物容易导致DNA的损伤。若损伤的DNA包括细胞周期控制因子,就会形成肿瘤,而华支睾吸虫感染也会增加内源性的亚硝基化作用,而后者也从另一方面参与癌变进程。

4.2 内源性致癌物形成增加 动物和人体感染华支睾吸虫可引起内源性的亚硝基化作用〔20〕。有研究报道感染华支睾吸虫的仓鼠,该吸虫寄生的胆管周围炎症区域巨噬细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞内的一氧化氮合酶被活化,与对照组相比被感染的仓鼠体内一氧化氮合酶的活性增加了2倍。该酶随后会增加硫代脯氨酸的内源性亚硝基化。从理论上讲,高浓度的NO可产生细胞毒作用以及诱变效应。此外,过多的NO在胆管癌的起始及发展过程中也发挥作用。在一项控制饮食(低亚硝酸盐)的研究中,华支睾吸虫病患者与对照组相比,华支睾吸虫感染者增加了内源性NO和亚硝基化合物的产生,表现为血浆和尿液中的硝酸盐、唾液中的亚硝酸盐浓度增加,脯氨酸和硫代脯氨酸的亚硝基化。肠胃外NO的氧化形成亚硝基化因子与胺反应,产生亚硝基化合物。此外,胆管周围的慢性炎症区域的炎性细胞产生NO也可导致该区域形成亚硝基化合物。胆管上皮细胞持续暴露于高浓度的亚硝基化合物,导致细胞的恶性转化。

4.3 致癌代谢酶活化 感染华支睾吸虫的雄仓鼠体内,肝细胞色素P450(cYP)的同工酶(特别是CYP2E1和CYP2A6)比对照组表现出更高的活性。紧邻炎症区域的肝细胞内这两种酶的活性最高。已证实伴有肝内胆管纤维化的华支睾吸虫病患者体内诱导了CYP2A6的表达,用吡喹酮驱虫治疗后2个月可观察到该酶活性的显著降低。DMN是组织内的一种内源性亚硝基化作用的产物,可由CYP2E1和CYP2A6两种酶代谢。此代谢反应的产物是一种DNA甲基化因子,可引起DNA的损伤,特别是在胆管上皮细胞的增殖过程中。用吡喹酮进行驱虫治疗后,这两种酶的水平明显下降。然而,慢性肝吸虫感染者该两种酶的活化机制尚未明确,其在华支睾吸虫感染后致癌作用也有待进一步研究。

4.4 NO产物的增加 在华支睾吸虫感染引起的慢性炎症区域内,巨噬细胞以及其他类型的细胞(如肥大细胞、嗜酸性粒细胞等),被寄生虫特异性的T细胞和细胞因子活化,诱导一氧化氮合酶表达,从L-精氨酸产生NO〔21〕。NO介导抗感染的同时也危害机体,可通过两个途径作用。一作用于宿主细胞代谢关键酶,这些酶活性部位Fe-S基团结合形成铁-亚硝酰基复合物,引起代谢酶中铁的丧失,酶的活性受到抑制,进而阻断宿主细胞能量合成、DNA复制,NO引起的铁丢失与细胞毒性呈平行关系;NO的另一个作用机制可能是NO与超氧阴离子(O2-)反应,生成过氧亚硝酸根(ONOO-),ONOO-质子化后迅速分裂成高毒性的羟自由基OH.和稳定的NO2,OH.活性很高体内诱发细胞多方面的损伤,ONOO-本身亦能引起DNA的解链,直接破坏细胞膜,使细胞膜发生功能障碍。NO衍生物引起DNA的损伤,导致细胞突变〔22〕。胆管上皮细胞长期暴露于该种具有遗传毒性的炎症产物中,形成了肿瘤恶变的适宜环境。

此外,华支睾吸虫感染后,可以引起细胞mRNA、caspase-3等的变化,这些变化在Fas/FasL介导的凋亡途径中起着重要的作用,细胞程序性死亡。研究发现肝吸虫感染后高水平Fas/FasL、caspase-3的mRNA和蛋白质的表达,介导的Fas信号,破坏肝脏解剖和功能机制〔23〕。Pinlaor〔24〕等发现华支睾吸虫诱发的炎症反应通过TLP-2介导的途径导致NF-kB介导的iNOS和COX-2表达,可能参与该吸虫感染相关的致病作用以及致癌作用。

上述几种可能的致癌作用机制,并不是单一作用,而是在华支睾吸虫相关性肝/胆管癌的发生过程中协调作用。单一的虫体感染可能不会立刻产生明显的肿瘤学变化。华支睾吸虫感染后虫卵及一些代谢产物和机械刺激,这种过程长期作用会加速肝/胆纤维化〔25〕、增生、癌变,尤其能加速已有病变组织恶变的进程。临床已有发现伴有血吸虫感染的乙型肝炎、丙型肝炎患者,肝功能更易受损,也更容易发生肝癌〔26〕。

5 展 望

在发展中国家华支睾吸虫感染所致的胆管癌仍是一个重要的健康问题〔27〕。为了降低这种影响,华支睾吸虫感染致癌的机理需要进一步的研究。尽管对华支睾吸虫感染与肝胆疾病之间的关系早有认知,并对肝吸虫的致癌作用进行了大量的临床和实验研究,但机制仍未十分明确。广大的学者正致力于其体外培养,感染动物模型,乃至基因水平、蛋白质组学分析华支睾吸虫蛋白质〔28〕、细胞学功能学等〔29〕各方的研究求证。正确的理论依据仍需大量准确可靠的实验数据支持,随着分子生物学免疫学实验技术的飞速发展以及各科各领域的相互渗透,我们可以借助先进的生物学技术进行大量严密的实验。敏感、特异、快速的分子生物学方法、实时定量PCR等已在华支睾吸虫上广泛应用并取得丰硕的研究成果〔30〕,这为早日阐明华支睾吸虫引起肝/胆癌机理、临床诊断、治疗以及药物研制开发提供科学理论依据。

〔1〕谢明权,李国清.现代寄生虫学〔M〕.广州:广东科技出版社2003:483-492.

〔2〕Zhou YM,Yin ZF,Yang JM,et al.Risk factors for intrahepatic cholangiocarcinoma:A case-control study in China〔J〕.World J Gastroenterol,2008;14(4):632-635.

〔4〕Pairojkul C,Shirai T,Hirohashi S,et al.Multistage carcinogenesis of liver-fluke-associated cholangiocarcinoma in Thailand〔J〕.Princess T akamatsu Symp,1991;22:77-86.

〔4〕Chuang SC,Vecchia CL,Boffetta P.Liver cancer:Descriptive epidemiology and risk factors other than HBV and HCV infection〔J〕.Cancer Lett,2008:15.

〔5〕Lan Anh NT,Phuong N T,Johansen MV,et al.Prevalence and risks for fishborne zoonotic trematode infections in domestic animals in a highly endemic area of North Vietnam〔J〕.Acta T rop,2009:4.

〔6〕汪邵平,霍枫,刘波,等.肝吸虫性胆管炎的临床特点〔J〕.世界华人消化杂志,2004,12(6):1487-1488.

〔7〕Lim MK,Ju YH,Franceschi S,et al.Clo-norchis sinensis infection and increasing risk of cholangiocarcino-ma in the Republic of Ko rea〔J〕.Am J T rop M ed Hyg,2006,7(5):93-96.

〔8〕黎学铭,方钟燎.胆管癌与华支睾吸虫感染关系〔J〕.中国人兽共患病杂志,1996,12(3):35-37.

〔9〕何东苟,徐劲,胡旭初,等.华支睾吸虫翻译控制肿瘤蛋白(TCT P)基因的鉴定及其编码区序列克隆〔J〕.中国人兽共患病杂志,2004,20(2):117-121.

〔10〕朱师晦,钟杏裳,罗章炎.中华分支华支睾吸虫病与其它肝胆疾病的关系〔J〕.中华内科杂志,1982,21(1):34-36.

〔11〕赵慰先.人体寄生虫学〔M〕.2版.北京:人民卫生出版社,1994:521-537.

〔12〕丘福禧.中华分支睾吸虫感染作为胆道、肝、胰腺等一些疾病致病因素的探讨〔J〕.中华医学杂志,1963,4(9):569-573.

〔13〕Thamavit W,Bhamarapravati N,Sabaphong S,et al.Efects of dimethylnitrosamine on induction ofcholangiocarcinoma in Opisthorchis viverrini-infected Syrian golden hamsters〔J〕.Cancer Res,1978;38(12):4634-4639.

〔14〕Koo J,Ho J,Wong J,et al.Mucoepidermoid carcinoma of the bile duct〔J〕.Ann Surg,1982,196:140-148.

〔15〕LeewJ,Lim HK,JangKM,et al.a spectrum of cholangiocarcinoma:emphasis on unusual manifestations and differential diagnoses〔J〕.Radiographics,2001,21(S)97-116.

〔16〕Thuluvath PJ,Rai R,Venbrux AC,et al.Cholang cholangiocarcinoma:a review〔J〕.Gastroenterologist,1997,5:306-315.

〔17〕王友顺,陈保华,余力,等.肝吸虫病合并胆管癌29例报告〔J〕.中华肝胆外科杂志,2003,9.611-613.

〔18〕Jennifer Keiser,Peter Odermatt,Smarn Tesana.Dose-response relationships and tegumental surface alterations in Opisthorchis viverrini following treatment with mefloquine in vivo and in vitro〔J〕.2009,105(1):261-266.

〔19〕田亚玲.浅谈华支睾吸虫病的检验诊断〔J〕.中华实用医药杂志,2004,7(4).78-80.

〔20〕Satarug S,Haswell Elkins MR,Tsuda M,et a1.Thiocyanate-independent nitrosation in humans with carcinogenic parasite infection〔J〕.Carcinogenesis,1996,17(5):1075-1081.

〔21〕Ohshima H,Bandaletova TY,Brouet I,et al.Increased nitrosamine and nitrate biosynthesis mediated by nitric oxide synthase induced in hamsters infected with liver fluke(Opisthorchisviverrini)〔J〕.Carcinogenesis,1994,15(2):271-275.

〔22〕赖植发.弓形虫感染对大鼠、小鼠血清一氧化氮水平的影响〔J〕.热带医学杂志,2006,6(4):362-366.

〔23〕Xiaoli Zhang,Zhanfeng Jin,Rong Da,et al.Fas/FasL-dependent apoptosis of hepatocytes induced in rat and patients with Clonorchis sinensis infection〔J〕.Parasitol Res,2008,103:393-399.

〔24〕Pinlaor S,Tada-Oikawa S,Hiraku Y,et al.Opistorchis viverrini antigen induces the expression of T oll-like receptor 2 in macrophage RAW cell line〔J〕.Parasitol,2005,35(6):591-596.

〔25〕胡凤玉,胡旭初,马长玲,等.华支睾吸虫分泌/排泄抗原致大鼠肝纤维化〔J〕.南方医科大学学报,2009,29(3)393-396.

〔26〕黄顺东,李艳,朱刚剑,等.血吸虫患者肝癌细胞P53、P16蛋白表达的相关性研究〔J〕.中西医结合肝病杂志,2007,17(6):333-360.

〔27〕Watanapa P,Watanapa WB.Liver fluke-associated cholangiocarcinoma〔J〕.Br J Surg,2002,89(8):962.

〔28〕Ju JW,Joo HN,Lee M R,et al.Identification of a serodiagnostic antigen,legumain,by immunoproteomic analy sis of excretory-secretory products of Clonorchis sinensis adult worms〔J〕.Proteomics,2009,9(11):3066.

〔29〕Young Ju Kim,Min-Ho Choi,Sung-T ae Hong,et al.Proliferative effects of excretory/secretory products from Clonorchis sinensis on the human epithelial cell line HEK293 via regulation of the transcription factor E2F1〔J〕.Parasitol Res,2008,102:411-417.

〔30〕Kim EM,Verweij JJ,Jalili A,et al.Detection of Clonorchis sinensis in stool samples using real-time PCR〔J〕.Ann T rop Med Parasitol,2009,103(6):513.