伤寒沙门菌诱导巨噬细胞凋亡机制的探讨*

刘婷婷,马丽娜,李凤云,刘 勇,樊 蓉

伤寒沙门菌(Salmonella typhi,S.typhi)是重要的肠道致病菌,属胞内寄生菌,它可引起伤寒等严重疾病。巨噬细胞是人体主要的吞噬细胞,它在许多病原体的清除和破坏中起重要作用。伤寒沙门菌在巨噬细胞内生存、增殖的能力与其致病密切相关。越来越多的研究报道伤寒沙门菌可以引起吞噬细胞的凋亡〔1〕,但伤寒沙门菌诱导巨噬细胞凋亡机制还有待进一步研究,本实验拟采用人白血病细胞系

THP-1细胞经PMA(佛波醇酯)分化的巨噬细胞为模型,探讨伤寒沙门菌对巨噬细胞凋亡的机制,以深入了解伤寒沙门菌的致病机制。

1 材料与方法

1.1 菌种 伤寒沙门菌标准菌株,购自生物制品鉴定所。

1.2 主要试剂与仪器 Annexin FITC凋亡检测试剂盒(深圳晶美生物工程公司)caspase3/8/9比色法检测试剂盒(Biovision公司),caspase3/8/9抑制剂(Biovision公司),抗人 TNF-α抗体(Peprotechinc公司)及人TNF-α定量酶联检测试剂盒(上海森雄生物技术有限公司),NO检测试剂盒(南京建成生物工程研究所),流式细胞仪FACSCalibur(美国BD公司)。

1.3 细胞培养 用含小牛血清的RPMI-1640培养液培养THP1细胞,加入20 ng/mL PMA使其分化,37。C ,5%CO2条件下培养48h,镜下观察90%以上细胞出现棘状突起,认为细胞已分化成巨噬细胞,收获指数生长期巨噬细胞,以5×105接种于无菌六孔板中,常规培养5h后更换成不含小牛血清的营养液进行试验。

1.4 细菌培养 细菌在LB液体培养基培养,16h后使用酶标仪OD 600检测菌液浓度,用不含小牛血清1640调整菌液浓度。

1.5 实验方法

1.5.1 细胞感染 弃去细胞培养孔中陈旧培养液,加入1.0 mL不含小牛血清营养液,按细菌与细胞数之比为20∶1加入细菌,实验分组如下:A组:伤寒沙门菌诱导组;B组:空白对照组。

1.5.2 细胞凋亡检测 2组于诱导因素加入后8h分别收集细胞,Annexin V-FITC染色,1h内流式细胞仪检测,Cellquest软件获取数据,WinMDI2.9软件分析数据。

1.5.3 凋亡抑制效应检测 在培养的细胞中加入终浓度分别为 20μg/mL TNF-α抗体、2μmol/mL caspase3/8/9抑制剂,各组诱导因素作用8h后收集细胞,Annexin V-FITC染色、流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.5.4 caspase3/8/9、TNF-α、NO 的检测:各组于诱导因素加入 8h后,获得上清后采用定量酶联法检测 TNF-α,按照说明书进行操作,酶标仪测量492nm处光密度OD值,根据标准曲线得到TNF-α含量。Caspase3/8/9检测采用比色法,收集作用8h后的细胞,按照说明书操作,酶标仪检测405 nm时的OD值。NO的检测采用硝酸还原酶法,检测步骤按说明书进行。测定550 nm吸光度值,根据公式计算NO浓度值。

1.6 数据处理 所得数据用SPSS10.0进行计算和分析。采用one-way ANOVA后t检验。

2 结 果

2.1 分别加入caspase3,caspase8,caspase9抑制剂及TNF-α抗体后伤寒沙门菌诱导巨噬细胞凋亡的流式分析图。

图1 加入caspase3/8/9抑制剂及抗TNF-α后伤寒沙门菌诱导巨噬细胞8h凋亡的AnnexinV-FITC流式分析图Fig.1 Analysis of Annexin V-FITC in macrophage apoptosis induced by S.typh i after theinhibitor of caspase3/8/9 and theanti-TNF-αThe marker M1 shows the percentage of Annexin positivecells.The black of the figure is the control.

2.2 比色法检测细胞中caspase3,caspase8,caspase9含量,伤寒沙门菌诱导巨噬细胞8 h收集细胞,使用细胞裂解液裂解,释放细胞内caspase3,caspase8,caspase9,分别加入相应荧光底物,酶标仪读取OD值,结果caspase3,caspase8均较对照升高(图 2)。

图2 伤寒沙门菌原菌诱导巨噬细胞8 h caspase3,caspase8,caspase9产生量(ni=6,±s)与对照组组比较:*P＜0.01;Fig.2 Caspase3,caspase8,caspase9 activity of macrophages infected with Salmonella typhi after 8h incubation compared to control:*P＜0.01

2.3 检测细胞培养液中TNF-α,NO含量,伤寒沙门菌诱导巨噬细胞8 h收集细胞培养液,采用硝酸还原酶法检测NO含量,ELISA检测TNF-α含量,结果均较对照组显著增高。(见图3,4)

图3 伤寒沙门菌诱导巨噬细胞8h NO产生量(ni=6, ±s)与对照组比较:*P＜0.01;Fig.3 NO(μmol/l)in the culture supernatants of macrophages infected with Salmonella typhi after 8 hours compared to control:*P＜0.01

3 讨 论

伤寒沙门菌感染致病的重要机制之一是在细胞内寄生,甚至繁殖。单核吞噬细胞是引发免疫应答的主要细胞,在免疫调节和维持机体内环境稳定方面具有重要的作用,它能吞噬和杀灭侵入的微生物,传递抗原,调节T细胞应答。巨噬细胞的分化、生存对免疫应答的深度至关重要〔1〕。越来越多的研究报道伤寒沙门菌可以引起吞噬细胞的凋亡,从而逃脱机体免疫系统的识别〔1-3〕,导致细菌在机体造成持续感染。

图4 伤寒沙门菌诱导巨噬细胞8h TNF-α产生量(ni=6,±s)与对照组比较:*P＜0.01;Fig.4 TNF-α(pg/mL)in the culture supernatants of macrophages infected with Salmonella typhi after 8 hours compared to control:*P＜0.01

本实验将伤寒沙门菌与巨噬细胞共培养,采用Annexin V-FITC染色、流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果发现伤寒沙门菌可以诱导巨噬细胞凋亡,且细胞凋亡可被caspase3和caspase8抑制剂及TNF-α抗体不同程度的抑制(P＜0.01),细菌感染组作用 8h后caspase3,caspase8及 TNF-α和NO含量均较对照组升高(P＜0.01),说明这些因子都参与伤寒沙门菌诱导巨噬细胞凋亡,caspase9抑制剂未能抑制伤寒沙门菌诱导的细胞凋亡,这与检测caspase9含量未见升高结果一致,说明caspase9未能参与伤寒沙门菌诱导的巨噬细胞凋亡。

经典的细胞凋亡途径有两条,分别为细胞外途径(细胞表面受体死亡途径)和细胞内途径(线粒体引发途径)。在细胞外途径中,死亡信号的传导依赖于死亡配体与受体的接合(如TNF-α与TNFR的结合),进一步激活caspase-8,使线粒体释放细胞色素C或直接作用于caspase-3及其它下游的caspase。在细胞内途径中,细胞内的死亡信号如DNA损伤、毒素和ATP耗竭等均可诱发线粒体释放细胞色素C,进一步顺序激活caspase-9、caspase-3、7等而诱发细胞凋亡〔4-5〕。

在革兰阴性菌内毒素脂多糖诱导巨噬细胞凋亡中,NO发挥重要作用。有报道细菌内毒素可引起小鼠灌洗液中NO2-/NO3-浓度显著增加,用一氧化氮合成酶抑制剂能阻断上述反应,提示NO的合成增加在巨噬细胞的凋亡中起到重要作用〔6〕。本实验研究发现伤寒沙门菌诱导巨噬细胞产生的NO浓度维持在较高水平,明显高于对照组,有研究表明NO可以增加caspase3的活性〔7〕,活化的 caspase3可以水解caspase活化酶抑制剂,从而使caspase激活的DNA酶裂解DNA〔8〕,这与本实验中caspase3活性增加导致细胞凋亡,加入caspase3抑制剂后凋亡有所下降的结果相一致。有报道TNF-α可引起不同类型细胞的凋亡〔9〕。Schuerwegh的研究发现在TNF-α诱导的牛软骨细胞凋亡中 NO起重要作用〔10〕。在细胞凋亡中,TNF-α同 caspase3的关系同NO和caspase3的关系一样得到证实〔11〕。Gup ta和Gollapudi发现在老年人体内的 T细胞凋亡增加与 caspase3及 TNF-α表达有关,在 TNF与TNF-α结合诱导免疫应答细胞凋亡时需要caspase3的活化〔12〕。本实验中,TNF-α介导的凋亡同伤寒沙门菌感染相关,采用抗人TNF-α抗体阻断TNF-α后细胞凋亡率明显下降,这与kim报道的结果相一致〔13〕。

总之,伤寒沙门菌可以诱导巨噬细胞凋亡,其凋亡机制可能是通过 TNF-α与其受体结合后激活NO和caspase3,caspase8介导的细胞外凋亡途径,本研究结果有助于我们更好的理解伤寒沙门菌的致病机理,为我们进一步的诊断与治疗提供了新的思路。

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