厦门地区病毒性腹泻诺如病毒感染状况*

郑惠能,李 莉,陈娟娟,黄仕杰,马桂林,温慧欣,沈理通,周常义,黄建炜

1972年Kapikian报道发现诺如病毒以来,越来越多的研究证实诺如病毒是急性胃肠炎暴发疫情最主要的病原,也是成人、儿童非菌性腹泻主要的病原体。由于缺乏简易、经济的检测手段,临床上尚难与其它病毒性腹泻相鉴别,其所造成的疾病负担并未引起人们足够重视。为了解厦门地区诺如病毒的流行状况,以便进一步探索本地区诺如病毒流行规律和流行因素,为制订防控对策提供依据,本研究于2007年4月至2008年7月在3家哨点医院开展监测,收集了323例病毒性腹泻患者粪便标本,采用ELISA和realtime RT-PCR法检测标本中诺如病毒抗原和核酸,分析该人群诺如病毒感染状况及特征。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 以厦门岛内的厦门市第一医院和厦门市妇幼保健院以及岛外的厦门市第三医院为监测哨点医院,按监测方案要求采集病毒性腹泻病例粪便标本。2007年4月至2008年7月共收集门诊和住院病毒性腹泻患者323例,采集粪便标本10～15g/份,-70℃冻存。病毒性腹泻病例定义为大便次数≥3次/d,呈水样、蛋花样或稀糊样便,常规镜检WBC＜15,RBC=0,排除常见细菌、寄生虫等感染的腹泻病例。

粪便标本诺如病毒抗原的ELISA检测。应用德国必发公司(R-Biopharm Rhone Ltd)第二代和第三代诺如病毒ELISA(RIDASCREEN Norovirus)试剂盒对粪便标本进行诺如病毒抗原检测。此试剂采用单克隆抗体夹心法,特异性检测GGⅠ和GGⅡ组诺如病毒的共同抗原。冻存的粪便标本溶解后,以试剂盒中的标本稀释液10倍稀释,振荡混匀、静置10 min后,室温5 000r/min离心5 min,取100μL上清液,按照试剂盒说明书检测和判断结果。

1.2 病毒RNA提取、检测与分型 粪便标本溶解后以生理盐水10倍稀释、振荡混匀,10 000r/min离心 5min;取 140μL 上清液,按照 QIAamp Viral RNA Mini KIT的说明书要求以柱离心法提取总RNA,洗脱液为60μL。取 5μL RNA 提取液以深圳太太基因工程公司的诺沃克病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒检测病毒RNA。阳性标本重提RNA后以上海之江诺如病毒荧光PCR(rRT-PCR)分型试剂盒(GGⅠ+Ⅱ)检测。核酸扩增使用ABI7500和Biometra PCR仪。

1.3 病毒型别的验证 随机取5份GGⅡ组诺如病毒RNA阳性的标本RNA提取液5μL,以QLAGEN OneStep RT-PCR KIT逆转录扩增病毒RdPd基因片段,引物序列为NVRPf 5'-ATACCACTATGATGCAGATTA-3'和NVRPr5'-TCATCATCACCATAGAAAGAG-3',RT-PCR产物2%琼脂糖胶电泳,回收327bp条带的扩增产物,以QIAquick Gel Extraction Kit纯化后送上海生物工程技术服务有限公司测序。获得的序列与Gen-Bank数据库比对,验证病毒的型别检测结果。

2 结 果

2.1 腹泻病例粪便标本的检测结果 323例门诊、住院的病毒性腹泻患者粪便标本,ELISA检测诺如病毒抗原阳性68例,阳性率为21.05%,其中,2007年9月20日以前,使用德国必发公司第二代诺如病毒ELISA试剂盒检测159例,阳性20例,阳性率12.58%;2007年9月20日以后,使用该厂家的第三代ELISA试剂盒检测164例,阳性48例,阳性率29.27%。323例患者粪便标本RT-PCR检测诺如病毒RNA阳性107例,阳性率为33.13%;抗原和RNA双阳性52例,抗原或RNA任一项阳性共123例,诺如病毒检出率为38.08%(123/323)。见表1。

2.2 诺如病毒感染病例分布特征 城市居民病毒性腹泻患者诺如病毒检出率为37.12%,农村患者检出率为40.43%,两者无显著性差异(χ2=0.31,P=0.5787);男性患者诺如病毒检出率为34.41%,女性患者检出率为38.59%,两者无显著性差异(χ2=0.05,P=0.8295);厦门岛内居民与岛外居民病毒性腹泻患者的诺如病毒检出率分别为32.63%和45.86%,岛外患者检出率高于岛内患者(χ2=5.79,P=0.0161);门诊与住院病例诺如病毒检出率分别为42.68%和25.30%,门诊病例检出率明显高于住院病例(χ2=7.71,P=0.0055)。

全年都有感染病例,以1、2月份诺如病毒检出率最高,分别为66.67%和70%。诺如病毒感染患者年龄最小为21日龄,最大为83岁。1岁以下婴儿腹泻病例诺如病毒检出率达27.50%;20岁至60岁组成人患者检出率为40%～50%。各年龄组的病毒性胃肠炎患者诺如病毒检出情况见表2。

2.3 病毒型别与验证 PCR阳性标本的型别组成:诺如病毒 GGⅡ80份(74.77%)、GGⅠ2份(1.87%)、未定型25份(23.36%)。

随机选取的5份NoV RNA阳性标本测序获得的序列完全相同,其中329bp碱基见下图,与Gen-Bank数据库比对,属于GGⅡ。如,粪便标本251的病毒核酸片段序列与GenBank Norovirus Hu/Duan/Beijing/2006/China比较,片段序列相似度99%(325/328),同属GGⅡ。

图1 粪便标本251诺如病毒基因与Norovirus Hu/Duan/Beijing/2006/China的片段序列比较Fig.1 Fecal samples RNA sequence comparisonsbetween 251 Norovirusgeneand NorovirusHu/Duan/Beijing/2006/China

3 讨 论

诺如病毒在世界各地都有广泛的传播。早年应用电镜和免疫电镜检测诺如病毒,但电镜检测方法灵敏度低,且受操作者影响较大,因此检出率较低。1992年后发展并使用RT-PCR方法检测诺如病毒,Frankhauser等在美国33个州1996年1月至1997年6月发生的90起非菌性急性胃肠炎暴发中发现96%的病原为诺如病毒〔1〕,荷兰、英国、日本和澳大利亚的研究也证实了诺如病毒是引起急性胃肠炎暴发的最主要病原〔2-3〕。方肇寅等对我国长春、北京、福州等13个地区1999-2005年5岁以下腹泻患儿轮状病毒阴性的粪便标本用ELISA和RT-PCR方法检测人类杯状病毒(HuCV),结果显示,HuCV阳性率 19%(8.3%～38.6%),其中诺如病毒占96.7%,绝大多数毒株为GG Ⅱ(92.47%)〔3〕。高志勇等报道北京地区病毒性胃肠炎患者诺如病毒检出率为 38.89%,97.14%为 GG Ⅱ〔4〕。

表1 各月份NoV病毒检测结果Table 1 NoV test results of different months in 2007 and 2008

表2 各年龄组NoV检测结果Table 2 NoV test results of different age subgroup

本研究显示,厦门地区病毒性腹泻患者诺如病毒检出率为 38.08%,流行优势株为 GGⅡ(74.77%),与国内研究结果基本相符。各年龄组均可感染诺如病毒,但以20-60岁组患者感染率最高,达40%～50%;全年均可检出诺如病毒感染,以冬春季的1、2月份为高峰,检出率分别达66.67%和70%,提示本地区1-2月可能为诺如病毒流行高峰。门诊与住院病例诺如病毒检出率分别为42.68%和25.30%,估计是由于诺如病毒性腹泻症状比轮状病毒性腹泻轻,住院患者一般症状较重,轮状病毒检出率高,诺如病毒检出率低,在门诊患者中情况则相反。40例1岁以下病毒性腹泻患儿(住院36例、门诊4例),诺如病毒的检出率达27.50%,住院患儿检出率为27.78%(10/36),虽然未进一步排除轮状病毒、札如病毒、肠道腺病毒等其他肠道病毒感染所致,但提示诺如病毒乃为本地区婴儿腹泻的重要病原,在婴幼儿冬春季腹泻临床诊断和治疗中,除轮状病毒外还应关注诺如病毒感染。

本研究还显示,厦门城市与农村地区的病毒性腹泻患者诺如病毒感染无显著性差异,可能与几年来厦门地区的城市化建设和社会经济的快速发展缩小了城乡居民在生活水平与享有卫生服务之间的差距有关。而厦门岛内的病毒性腹泻患者诺如病毒感染率比岛外的低的研究结果,则可能与厦门岛内居民的文化程度、经济条件、个人卫生习惯以及岛内良好的卫生环境、城市基础设施建设、卫生城市管理等有密切关联,对其影响因素有待进一步研究,它将有助于科学制定防控策略和更有针对性的防控措施。

〔1〕Fankhauser RL,Noel JS,Monroe SS,et al.Molecular epidemiology of“Norwalk like viruses” in outbreaks of gastroeneuritis in the United States〔J〕.J Journal of Infect Disease,1998,178:1571-1578.

〔2〕Reuter G,Farkas T,Berke T ,et al.Molecular epidemiology of human calicivirus gastroenteritis outbreaks in Hungary,1998 to 2000〔J〕.J Med Virol,2002,68(3):390-398.

〔3〕方肇寅,谢华萍,吕红霞,等,1999-2005年我国婴幼儿人杯状病毒腹泻研究〔J〕,病毒学报,2007,23(1):9-15.

〔4〕高志勇,吕虹,黄芳,等,90例病毒性胃肠炎患者粪便中诺如病毒检出情况分析〔J〕,中国病原生物学杂志,2008,3(8):564-567.