河北省猪场脑心肌炎病毒感染的血清学调查*

刘兰亚,陈春花,许玉静,宋勤叶,李潭清

脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)属于微 RNA病毒科、心病毒属成员,其易感宿主广泛,是多种脊椎动物和人类脑心肌炎的病原,可导致动物和人类发生脑炎、心肌炎或心肌周围炎〔1-3〕。大鼠和小鼠是EMCV的自然宿主,家畜中以猪对EMCV的易感性最高,哺乳仔猪感染后出现急性致死性心肌炎,死亡率可达100%,妊娠母猪则以流产、死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍为主要特征,其他猪多呈隐性感染状态〔4-6〕。据报道猪脑心肌炎高发地区,人 EMCV感染的病例也较高〔7〕。人类感染EMCV后出现发热、头痛、颈部僵硬、昏睡、谵语、呕吐等症状,有学者从患脑膜炎和脑炎的儿童体内分离到EMCV,并从患者和其他正常人群血清中检测到EMCV 抗体〔2-3,8〕。

猪脑心肌炎自1958年首次在巴拿马报道并证明EMCV为其病原后,目前全球多个国家和地区有该病发生和流行的报道,但不同地区EMCV的抗体阳性率不同〔6,9,10-11〕。国内于2007年首次从病死仔猪或流产胎儿分离到EMCV,随后证明了多个省区的猪场有EMCV感染存在,不同地区的抗体阳性率在39.64%～90%之间〔12-14〕。鉴于 EMCV 是一个重要的人兽共患病致病因子,因此,明确当地猪场EMCV感染的流行状况,对减少猪场经济损失和保证人类健康均具有重要意义。本文旨在对河北省不同猪场EMCV的感染情况进行血清学调查,以便为EMCV的有效防控提供流行病学资料。

1 材料与方法

1.1 血清样本 2006-2008年,从河北保定、沧州、承德、邯郸、廊坊、衡水、唐山、秦皇岛、石家庄、邢台等10个地区的31个规模化猪场采集的不同生长阶段猪的血清样本,共计1 306份。

1.2 试剂 EMCV重组非结构蛋白2C与猪EMCV抗体阳性、阴性血清:河北农业大学动物传染病实验室制备并保存;小牛血清:购自中美合资兰州民海生物工程有限公司;HRP-羊抗猪 IgG:购自Solarbio公司。

1.3 EMCV抗体检测 应用间接ELISA方法检测血清抗体,包被抗原(EMCV重组蛋白2C)的制备与ELISA操作程序参见文献〔15〕。ELISA的基本操作步骤如下:以1 μ g/mL的重组蛋白2C包被酶标板,于37℃孵育1 h后4℃作用过夜;PBST(含0.05%Tween-20的 0.01 mol/L pH7.4 PBS)洗板3次,3 min/次;每孔加入100μL封闭液(含5%犊牛血清的PBST)于37 ℃封闭1 h;弃去封闭液,每孔加入1︰20倍稀释的待检血清100μL于37℃下反应 1 h;洗板,方法同上;每孔加入 100μL 1 ︰400稀释的酶标二抗,于37℃反应45 min;洗板,方法同上;每孔加入100μL底物(TMB),于室温避光显色 15 min,加入 50μL 2 mol/L H2SO4终止液 ,终止反应;用酶联检测仪测定OD450nm光吸收值。当被检样本的 OD450 nm值＞0.27时,判定为阳性;当OD450 nm值＜0.27时,判定为阴性。

2 结 果

2.1 河北省猪群脑心肌炎抗体的ELISA监测结果被检测的1 306份血清样本中,脑心肌炎抗体的总阳性率为13.48%(176/1 306),调查的10个地区中6个为抗体阳性。抗体阳性地区的感染率不同(5%～26%)(表1)。上述结果表明,河北省60%(6/10)的地区已经存在猪EMCV感染现象,但不同地区的感染情况存在差异。

2.2 不同生长阶段猪群EMCV抗体阳性率的比较依据EMCV抗体检测结果,对569份EMCV抗体阳性血清与猪日龄的关系进行了分析,发现不同生长阶段猪的EMCV抗体阳性率不同,其中经产母猪与后备母猪的抗体阳性率较高,分别为27.68%(31/112)和16.67%(5/30),仔猪与育成猪的抗体阳性率较低,分别为2.86%(5/175)和1.98%(5/252)(图1)。该结果表明,带毒母猪是猪群EMCV感染发生的主要原因之一。

表1 血清来源及EMCV抗体阳性率Table 1 Source of swine serum samples and positive rates of antibody to EMCV

图1 不同生长阶段猪群EMCV抗体阳性率Fig.1 Positive rates of antibodies to EMCV in pigs at different ages

3 讨 论

EMCV广泛流行于欧洲、美洲、亚洲等世界多个国家和地区〔6,9-11,14〕,不仅可以直接导致哺乳仔猪急性死亡和妊娠母猪繁殖障碍,而且能够在成活猪群中呈隐性感染形式长期存在,给养猪业造成较大的经济损失。同时,由于其易感宿主广泛,可以跨种间传播,尤其是能够引起人类感染与发病〔2-3,7〕,已有实验证明EMCV可以在人心肌细胞内增殖〔16〕,并且猪与人类关系密切,猪的组织器官是动物—人类间器官移植的首选对象。因此,开展猪EMCV感染的流行病学调查对猪脑心肌炎的有效防治与保证人类健康具有重要实践意义。猪脑心肌炎流行病学调查常用的血清学方法为血清中和试验(SNT),但SNT操作繁琐、费用较高,不适合进行大规模样本检测,在一定程度上影响和限制了猪脑心肌炎流行病学调查资料的广泛获取和临床诊断。先前研究〔15〕已证实基于EMCV重组非结构蛋白2C的间接ELISA与SNT的符合率为96%,特异性高,不与感染猪的常见病原如猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒等的抗体发生交叉反应,可以取代SNT用于EMCV感染的早期诊断与血清流行病学调查。所以本研究中采用了基于EMCV重组非结构蛋白2C作为包被抗原的间接ELISA方法检测EMCV抗体。

对2006-2008年间河北省10个地区31个猪场的1 306份血清样本的检测结果显示,EMCV抗体总阳性率为13.48%,高于法国(2006)和韩国(2009)猪群EMCV抗体的监测结果(2.48%和9.1%)〔11,17〕,但低于张家龙等(2007)〔14〕报道 的2005-2006年间河北部分猪场的EMCV抗体阳性率85.04%,这可能与血清来源和采集时间不同有关,因为一种疫病在不同地区或猪场、同一地区不同时期的感染与流行情况常存在明显差异。在被调查的10个地区中6个检测到了相应的抗体,4个为抗体阴性,表明河北省大多数地区已经存在EMCV感染现象,但不同地区猪场EMCV的感染率不同(5%～26%)。此结果提示,有关部门应重视猪脑心肌炎的防控,以免其进一步扩散与流行,甚至引发公共卫生事件。

进一步对不同饲养阶段猪的EMCV抗体阳性率的分析结果表明,经产母猪和后备母猪的抗体阳性率(27.68%和16.67%)明显高于仔猪和育成猪(2.86%和1.98%),该结果与文献〔9〕报道的美国依俄华州成年母猪和后备母猪的抗体阳性率(17.2%)高于育成猪(12.2%)的分布趋势类似。同样,国内2005-2006年间猪群EMCV感染的血清学调查结果也表明母猪的抗体阳性率(96.39%)高于其他生长阶段猪的抗体阳性率〔14〕。综合上述不同国家(地区)或时期猪EMCV感染的血清学调查结果,充分说明种母猪在EMCV的传播与流行中占有重要地位,并提示在猪繁殖障碍疫病中EMCV的作用不容忽视,因此需要进一步加强猪群繁殖障碍类疫病的病原学研究,明确EMCV的危害,为制定有效防控措施提供科学依据。

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