神经营养素-3修复脊髓损伤的研究进展

党彦丽,李俊岑,杨拯,田芸,张晓

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后脊髓的修复重建是一个研究难题。目前的研究表明,脊髓损伤后神经营养因子缺乏是导致脊髓损伤后功能恢复差的重要原因之一,神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)是神经营养素家族的重要成员,具有广泛的生理学作用。近年来众多学者表明NT-3在神经损伤的修复方面起着重要的作用,对脊髓损伤的修复有很好的效果。

1 NT-3的结构和生物学作用

NT-3是由Ernfors等于1990年发现的继神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)之后神经营养素家族的重要成员,它是一种小分子量的碱性蛋白质。成熟的NT-3由119个氨基酸残基构成,有6个保守的半胱氨酸并形成3对二硫键,保守序列集中在半胱氨酸附近[1]。

NT-3的功能部位存在于周围神经系统、中枢神经系统的不同部位与肠神经系统[2]。它的作用广泛:①促进神经元的生长、发育、分化和成熟,对多种神经元具有神经保护和营养作用;②阻止胚胎期及出生后运动神经元细胞死亡,维持损伤脊髓神经元的存活,促使轴突延伸,提高神经细胞轴突再生的内在再生能力;③促进脊髓损伤后皮质脊髓束纤维、背柱感觉传导纤维及背根节纤维的出芽和再生;④促进再生轴突的髓鞘化[3],减慢横切损伤脊髓神经元死亡速度[4];⑤选择性的加强脊髓神经元的存活和生长发育[5]。此外,外源性的N T-3可阻止皮层运动神经元、红核、背核及脊髓感觉投射神经元轴突离断后的凋亡,促进其存活。

2 NT-3多途径修复SCI

2.1 基因移植 目前,在基因移植修复SCI方面,研究最广泛的主要是NT-3与神经干细胞联合移植和N T-3与骨髓间充质干细胞联合移植修复脊髓损伤。

2.1.1 NT-3与神经干细胞联合移植 神经干细胞(neural stem cells,NSCs)存在于成年哺乳动物的脊髓、海马和室管膜下层。它具有自我复制和多向分化潜能[6],经多次分裂后仍能稳定地保持自身的特性。

单纯移植NSCs能促进脊髓损伤后受损伤神经元的存活与神经纤维再生,但是单纯移植NSCs引起的神经元存活与轴突再生是有限的。NT-3不仅能防止脊髓损伤后神经元的萎缩,促进受损伤的上行和下行轴突再生[7,8],还具有促进NSCs向神经元分化的作用[9]。NSCs移植到损伤后的脊髓中能够存活并保持增殖活性,分化为神经元,从而替代死亡的宿主神经元,并可能与损伤处两端的神经突起形成突触联系[10],以桥接的方式促进神经通路的重建。Himes等的研究表明,将编码神经营养素-3的基因片段导入NSCs,使其在移植部位进行表达,改善局部微环境,可促进失突触神经元的生存和增殖[11],进而促进损伤脊髓的功能恢复[12]。Blesch等应用NT-3基因修饰NSCs,移植入大鼠C3损伤SCI动物模型中,2周后发现相对于未修饰的NSCs移植组,NT-3基因修饰组可见高水平的神经生长因子(NGF)及脑源神经营养因子(BDNF)的分泌,以及大量感觉神经投射形成,并且60%分化为神经元,3%分化为胶质细胞[13]。可见,NT-3基因修饰的NSCs移植不仅可替代因损伤而发生死亡的神经元,而且还可以分泌促进神经元存活及轴突再生的神经营养因子。

2.1.2 NT-3与骨髓间充质干细胞联合移植 骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种骨髓中造血的结构性和功能性支持细胞,能分泌多种生长因子,对多种组织起支持作用。BMSCs能够自我复制、自我更新,特性稳定,连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能[14]。目前认为骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的机制可能为:①分泌多种神经营养因子,改善脊髓局部微环境并启动再生相关基因的顺序表达,从而促进轴突的再生。②使损伤的脱髓鞘轴索再髓鞘化。③桥接脊髓损伤断端,形成功能性突触,重新建立神经传导通路[15]。将BMSCs直接植入到标准化的脊髓损伤模型中,可分化为具有神经元或胶质细胞特征的细胞[16],促进功能的恢复[17]。

Lauren等在定量分析BMSCs分泌的神经营养因子中,发现包括BDNF和NGF在内的许多神经营养因子,而未检测到NT-3的表达[18]。为了将BMSCs和NT-3有效地结合起来运用到脊髓损伤的治疗中,有实验研究[19]根据BMSCs能很好地结合到中枢神经系统损伤部位的特点,把BMSCs作为一个理想的载体细胞,将神经营养因子靶向脊髓[20]。NT-3基因在脂质体的介导下转染到体外培养的大鼠BMSCs中,从而使BMSCs携带NT-3基因,观察靶细胞中NT-3基因的表达水平。研究表明,BMSCs可稳定、高效表达外源基因,并于转染后的BMSCs中检测到NT-3蛋白的表达。表达的NT-3可促进神经元的存活,诱导内源细胞增殖和促进神经纤维的再生[21]。轴突再生是神经修复的重要组成,移植BMSCs就像“桥梁”一样为轴突的再生提供支架,或引导、趋化轴突向前生长,抑制胶质细胞、防止瘢痕修复,让再生的神经元轴突顺利通过损伤处,使损伤神经轴索再髓鞘化[22],为损伤脊髓的两侧残端建立新的突触联系创造条件,重建神经通路[23]。NT-3与BMSCs联合移植的成功为脊髓损伤的修复奠定了坚实的基础。

2.2 载体介导 载体介导的基因治疗,是在体外将目的基因导入适当的移植细胞后,筛选出能够高效表达目的基因的移植细胞并移植到体内靶组织,通过提高局部NT-3的浓度,促进脊髓损伤的恢复。

2.2.1 病毒载体介导 病毒载体包括单纯疱疹病毒(HSV)、腺病毒(Adv)、腺相关病毒(AAV)和慢病毒(Lv)载体[24]。由于Adv载体可以携带多种神经营养因子基因并有效地转染神经元和胶质细胞,所以应用较为广泛[25]。将携带胶质源性的NT-3重组腺病毒转入鼠脊髓横断损伤的后肢骨骼肌中,结果在腰段脊髓的运动神经元中发现携带胶质源性的NT-3表达,并保护运动神经元免于轴突断裂诱发的细胞死亡[26]。在SCI的实验动物模型中,将带有NT-3基因的重组腺病毒微注射入周围神经段中移植到脊髓半横贯损伤处形成“再生桥”,可见有相当多的神经元重新长出皮质脊髓束到损伤处或损伤处远端,有明显的后肢功能恢复[27,28]。但是,病毒载体都有一个共同的缺陷在于会产生免疫反应或细胞毒性,甚至致癌[29]。考虑到病毒载体的局限性,目前非病毒载体的研究倍受人们的关注。

2.2.2 非病毒载体介导 非病毒载体可以克服病毒载体的缺陷,具有低细胞毒性和低免疫反应等特性。Wu Jun[30]等利用NT-3基因非病毒载体转染嗅鞘细胞,结果表明非病毒载体介导转染细胞很安全,并且能够高效能的表达NT-3,同时促进轴突向外生长来增强脊髓损伤修复。因此,非病毒载体可以广泛地运用到临床研究中,以弥补病毒载体的不足。

2.3 克隆 由于NT-3在组织中含量极微以及分布不均,要获得大量NT-3通过组织提取还有一定的困难,并且很昂贵,因此采用克隆的方法为NT-3治疗脊髓损伤带来新的曙光。陈昌杰等从人脑基因组DNA获取NT-3,并对其进行基因测序,然后运用基因工程的方法在体外克隆出大量的NT-3,导入损伤部位进行修复[31]。邓兴力等应用RT-PCR成功从大鼠脑组织中克隆出NT-3 cDNA,然后运用基因重组技术将其插入质粒载体构建真核表达质粒,植入损伤部位使其表达达到治疗效果[32]。因此,通过克隆使NT-3广泛地存在于损伤部位可以有效促进脊髓再生,从而加快功能的恢复。

2.4 直接注射 逆向运输的神经营养因子缺乏是造成周围神经损伤时运动神经元死亡的主要原因之一[33],而NT-3能够减少神经元的死亡。由于此种疾病需要长期用药,所以,能使脊髓前角神经元长期表达成为一种行之有效的办法。李志全[34]等根据脊髓直接注射可以减轻神经根撕脱伤[35],将重组的NT-3直接注入损伤部位,使其在局部持续表达,通过影响超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的表达来达到保护神经元的目的[36]。研究表明此种方法对脊髓神经元的存活和再生具有双重作用。

2.5 督脉电针治疗 督脉电针治疗能够增高脊髓损伤处邻近组织的N T-3水平,但其作用机制目前尚不清楚。有人推测,其机制可能是激活了宿主脊髓组织的神经胶质细胞和神经元的NT-3表达所致[37]。有研究用电针作用于脊髓部分背根切除术的大鼠,观察到邻近保留背根的背根节神经胶质细胞和神经元的N T-3 mRNA及其蛋白表达都有增加[38]。

3 展望

大量文献已经表明NT-3对脊髓损伤修复的促进作用,因此,通过补充神经营养素-3来治疗脊髓损伤成为一种行之有效的方法。不同的治疗途径往往会对神经元的存活和再生起到不同的效果,从而影响修复的效果。基因治疗是一种重要手段,在动物实验中已取得好的效果,但由于安全性的问题还没有进行脊髓损伤方面的临床试验。相信随着研究的深入会有很好的临床应用前景。

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