氨在肝性脑病发病机制中的作用

张清俊,刘雁勇,刘赫,左萍萍

肝性脑病(hepatic encephalopathy,HE)是以临床上各种严重肝脏疾病所致的以代谢紊乱为基础的中枢神经系统功能失调综合征。其临床表现有意识障碍、行为异常、昏迷、扑翼样震颤、构音障碍、出现病理反射、脑电图异常、血氨升高等。1998年,第11届世界消化病协会将肝性脑病重新定义,由不同病因引起的HE分为A、B、C三型,其中将过去称为亚临床HE和隐性HE正式命名为轻微 HE(Minimal HE,M HE),将MHE视为HE发病过程中的一个特殊阶段[1]。

HE是肝脏解毒功能不全和衰竭表现,其发病机制尚未完全阐明。目前存在的假说主要有:氨中毒、假性神经递质、GABA、血浆氨基酸失衡、锰中毒等。其中氨中毒学说在HE的发病机制中占主要地位,降血氨是治疗HE的有效措施之一。本文结合氨的代谢、特别是病理状态氨的代谢异常所致氨中毒在HE发病机制中的作用进行综述。

1 氨在体内的代谢

氨在体内是一种有毒的物质。体内氨的主要来源有:①氨基酸经脱氨基作用产生的氨是主要来源;②由肠道吸收的氨,包括肠内氨基酸在肠道细菌作用下产生的氨和肠道尿素经细菌尿素酶水解产生的氨;③肾小管上皮细胞分泌的氨,主要来自谷氨酰胺酶催化谷氨酰胺的水解。氨在体内的转运方式有丙氨酸-葡萄糖循环和谷氨酰胺循环。其中,肌肉中的丙酮酸在谷丙转氨酶的作用下生成丙氨酸将肌肉中生成的氨转移到肝;脑、肌肉等组织内的氨与谷氨酸在谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)的作用下生成谷氨酰胺,将氨转运到肝和肾。氨主要在肝内合成尿素和经肾小管分泌排出体外。

2 氨对机体的影响

2.1 氨引起星形胶质细胞肿胀 星形胶质细胞是大脑中含量最丰富的一种大胶质细胞,主要功能有:①参与血脑屏障结构与功能的完整性;②GS特异性的存在于星形胶质细胞中,参与氨在神经系统的代谢;③支持、营养和保护神经元,引导神经元迁移,分泌神经生长因子等;④细胞膜上有许多神经递质的转运体,参与γ氨基丁酸(GABA)、谷氨酸的代谢,还能摄取和灭活单胺递质,如5-羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺素等;⑤调节神经细胞内外离子,维持神经元内外的离子浓度及pH值稳定等。神经胶质细胞酸性纤维蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是星形胶质细胞特有的细胞骨架蛋白,也是星形胶质细胞损伤鉴定的标志。

大量研究表明,氨在体内、外均可引起星形胶质细胞肿胀。临床检查结果表明,星形胶质细胞肿胀也是急性肝衰竭时脑水肿的细胞病理基础。Rama Rao等采用体外神经元细胞和星形胶质细胞共培养技术,观察到星形胶质细胞可以明显减轻氨引起的神经元损伤作用[2]。这也提示当星形胶质细胞功能受损时,神经元更容易遭受内外环境改变引起的损伤。Konopacka等研究发现,蛋白激酶PKG在氨引起的星形胶质细胞肿胀过程中起着重要作用,脑内cGMP及血氨的联合升高会加重脑水肿[3]。Norenberg等对星形胶质细胞的肿胀机理进行总结,包括氧化/硝基化应激、线粒体通透性改变、谷氨酰胺和信号蛋白改变等,认为星形胶质细胞肿胀是多种因素作用的共同结果,其中氨是触发这些效应的原始诱因[4]。细胞内Ca2+升高、氧化应激、MAP激酶的激活、诱导M PT和激活转录因子 NF-κ B,均是由氨作用于神经系统特别是星形胶质细胞而产生的一系列复杂结果,他们对星形胶质细胞功能障碍、HE发病机制和氨神经毒性起着重要作用[5]。

2.2 氨引起的能量代谢障碍 过去的几十年,人们对氨引起的能量代谢改变进行了大量研究,Rama Rao等[6]总结了氨对机体能量代谢的影响:①糖利用:HE患者脑内葡萄糖的代谢率明显降低,而在高血氨大鼠动物模型大脑皮层葡萄糖的代谢率亦明显降低,丘脑和下丘脑葡萄糖的代谢率却明显增加。②糖酵解:在高血氨大鼠动物模型大脑糖酵解明显增加,糖酵解途径中的酶如磷酸果糖激酶、二磷酸果糖酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶和丙酮酸激酶活性增加。在一种先天性高血氨spf小鼠可以持续观察到脑内葡萄糖含量增加、丙酮酸含量降低,表明其脑内存在糖酵解紊乱。③三羧酸循环:氨消耗三羧酸循环的中间产物α-酮戊二酸、NADH+,合成谷氨酸,导致前两种物质含量的降低。体外脑线粒体氨处理后,可引起α-酮戊二酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶活性降低。此外,细胞内苹果酸-天冬氨酸穿梭系统将NADH从胞浆转移至线粒体,以确保线粒体内氧化磷酸化的进行。以前认为氨在脑内引起谷氨酸含量的降低是引起苹果酸-天冬氨酸穿梭系统抑制的诱因,而最近研究表明高氨条件下胞浆和线粒体内天冬氨酸转氨酶以及线粒体苹果酸脱氢酶活性降低,对苹果酸-天冬氨酸穿梭系统也有不利的影响。④线粒体呼吸:对先天性高血氨spf小鼠研究发现,氨可以抑制多种电子传递链复合体,特别是复合体Ⅳ(细胞色素C氧化酶)。进一步观察发现,与非突触内线粒体相比,氨对突触内线粒体电子传递链复合体抑制作用更加明显。⑤ATP的合成及利用:在spf小鼠和氨处理的星形胶质细胞,可以观察到ATP含量明显降低。NO能够激活神经元线粒体和细胞液中多种酶,抑制星形胶质细胞中谷氨酰胺合成酶的活性。Ca2+-CM激活蛋白磷酸酶,抑制蛋白激酶PKC磷酸化,从而激活ATP酶。NMDA受体中过量的Na+被清除,而这一过程消耗大量ATP。细胞液中过量的Ca2+进入线粒体,导致线粒体内Ca2+蓄积,抑制线粒体呼吸,减少ATP合成,增加氧化应激自由基的形成。以上过程导致ATP下降[7]。⑥糖原:糖原是脑内一种重要的能量储备,在神经活动增加时被分解利用。星形胶质细胞含有大量的糖原。氨处理星形胶质细胞1 d可以短暂引起细胞内糖原含量降低,3 d后可以抑制去甲肾上腺素诱导的糖原分解。这些结果提示,氨抑制细胞内糖原分解导致神经活动增加时能量供应的降低。

2.3 氨引起的线粒体通透性转换 线粒体通透性转换(mitochondrial permeability transition,MPT)可能参与氨引起的线粒体失能。MPT是指线粒体内膜对小分子(＜1.5 kDa)物质的通透性突然增加,这是由位于线粒体内膜的通透性转换孔(permeability transition pore,PTP)突然开放引起的。MPT作用的直接结果是使线粒体内膜电位(△Ψm)的消失,△Ψm的消失会引起线粒体基质肿胀、氧化磷酸化不全、ATP合成障碍以及产生活性氧(ROS)。MPT产生的后果可能是细胞的凋亡或坏死。

目前尚未完全阐明PTP的精确构成,已知结构如图1所示。其结构包括腺苷酸转位体(ANT)、电压依赖性阴离子通道(VDAC)、外周型苯二氮 受体(Peripheral-type benzodiazepine receptor,PBR)、癌蛋白Bcl-2、己糖激酶(HK)和肌酸激酶(CK)等。诱发 MPT的因素有线粒体内Ca2+浓度增加、膜上巯基和吡啶核苷酸的氧化还原状态、基质pH增加、△Ψm的去极化、ROS和一氧化氮(NO)增加、PBR增加等。环孢霉素 A(CsA)可竞争性抑制线粒体基质蛋白CyP-D,可以特异性地抑制M PT。

图1 线粒体通透性转换孔(PTP)的结构(from Rama Rao,et al.,2003)

Rama Rao等采用多种实验方法证实氨可以诱导线粒体发生M PT。采用膜电位荧光探针JC-1和TM RE的实验结果显示,氨处理培养的星形胶质细胞后引起线粒体△Ψm降低,将细胞与CsA共孵育则可抑制△Ψm降低。采用2-脱氧-6-磷酸葡萄糖(2-DG-6-P)作为指示剂,发现浓度为5 mmol/L的NH4Cl以时间-浓度依赖性方式引起星形胶质细胞的线粒体对2-DG-6-P通透性增加。采用钙黄绿荧光素作为荧光探针,氯化钴作为荧光淬灭剂,由于后者不能透过正常的线粒体膜,所以不能淬灭进入正常线粒体的钙黄绿荧光素,而只有在发生MPT时,氯化钴才可进入线粒体淬灭其荧光。使用这种方法,可以直接观察到NH4Cl处理星形胶质细胞24 h后,线粒体内荧光强度明显降低[8]。以上的研究结果均证明氨可引起线粒体的MPT。

如图1所示,PBR是线粒体PTP的一个组成亚基,PBR与存在于中枢GABA受体上的苯二氮 受体在分子结构、药理学特性、体内分布方面均不相同。在HE患者、试验性肝衰竭动物模型以及氨处理的星形胶质细胞,均发现PBR密度上调。PBR受体增加一方面可能促进神经类固醇激素的产生,后者进一步上调GABAA受体,产生神经抑制作用;另一方面可能诱发线粒体的M PT。Rama Rao等使用nmol级的PBR配体与星形胶质细胞孵育后,可以观察到PBR诱发的线粒体MPT[8]。PBR诱发线粒体MPT的机制还不明确,可能与PBR配体引起的细胞氧化应激有关[9]。

2.4 氨引起的氧化应激效应 1990年O'Connor和Costell首先发现高血氨小鼠的肝、脑内脂质过氧化物增加以来,氨引起的氧化应激效应随后受到人们的重视。临床尸检发现,HE患者脑内可见一种特征性的AlzheimerⅡ型星形胶质细胞,胞核大而苍白,核周围有脂褐素聚积,在这些脂褐素中有大量的过氧化脂质。而在氨处理的星形胶质细胞和视网膜Müller细胞均可发现这种过量的脂褐素样颗粒。这说明 HE患者脑内的AlzheimerⅡ型星形胶质细胞与氨引起的氧化应激有关。

关于氨引起体外培养的星形胶质细胞中氧化应激的研究比较多。氨可以引起细胞内GSH含量降低,而GSH通过维持蛋白巯基的还原状态使蛋白质维持正常的空间构象和活性。进一步研究发现,氨可以抑制星形胶质细胞摄取胱氨酸,而胱氨酸是合成GSH的原料,其含量降低预示着细胞更容易遭受氧化应激。氨可以使星形胶质细胞形态发生改变,如星型形状增强、胞浆空泡、浓缩及嗜碱性增加,而用抗氧化酶SOD和CAT可以完全抑制细胞形态的这种改变。氨引起自由基产生增加的机制还不明确,一种推测是氨激活了N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体,另一种推测是引起线粒体MPT,造成线粒体失能,氧化磷酸化不完全,从而产生大量的ROS。

氨可引起细胞内谷氨酰胺合成增加。谷氨酰胺参与体内氨的解毒、合成谷胱甘肽及核苷酸等。然而高浓度的谷氨酰胺也可以间接导致自由基的产生。用磷酸化激活谷氨酰胺酶(PAG)的抑制剂可以阻断6.5 mmol/L谷氨酰胺引起的星形胶质细胞自由基产生,PAG抑制剂可抑制谷氨酰胺分解为氨和谷氨酸,这说明谷氨酰胺在分解时产生的氨可诱发自由基的产生。在高氨环境中的星型细胞内,过多的谷氨酰胺被线粒体内的PAG分解,在线粒体内产生高浓度的氨,造成线粒体产生MPT,进而产生 ROS。谷氨酰胺以“特洛伊木马”的方式侵入线粒体,释放出氨,诱导线粒体ROS产生,最终导致谷氨酰胺的神经氧化应激损伤效应。

如前所述,在HE患者、试验性肝衰竭动物模型以及氨处理的星形胶质细胞,均发现PBR密度上调。进一步研究发现,PBR激动剂可以直接导致星形胶质细胞自由基的产生。在培养的星型细胞和神经元细胞中,分别加入10 nM的PBR激动剂如PK11195、Ro5-4864和PpIX后,结果发现,对于星形胶质细胞,所有的激动剂作用2 min均可导致自由基产生的增加;对于神经元细胞,PK11195和PpIX作用2 min仅导致自由基产生的短暂增加,而Ro5-4864无作用,这种差别可能与 PBR在不同细胞内的分布差异有关[10]。

氨引起氧化应激反应,通过酪氨酸残基硝基化、星形胶质细胞和神经元细胞 RNA氧化导致蛋白质修饰。氨导致的RNA和蛋白质氧化可能减少突触后蛋白质合成,影响学习记忆功能。RNA氧化为HE患者神经递质系统和基因表达的多重紊乱以及认知障碍提供了新的解释[11]。

2.5 氨引起GABA能神经递质的改变 GABA是一种抑制性神经递质。进入线粒体的氨与α-酮戊二酸结合成谷氨酸,然后在谷氨酸脱羧酶的作用下生成GABA,通过激活GABA受体产生生物效应。GABA受体分为GABAA、GABAB和GABAC3种类型。GABAA受体主要分布在脑内,激活后使氯离子内流增加,导致突触后膜超极化,从而产生神经抑制作用。GABAA受体复合物的主要调控点包括苯二氮 (BZ)、巴比妥类、神经类固醇和印防己毒素等。

氨可以直接与GABAA受体复合物相互作用,增强GABA能神经递质的作用。利用放射配体结合试验,发现0.05～0.5 mmol/L的氨可提高蝇蕈醇(GABAA受体激动剂)和氟硝西泮(苯二氮 受体激动剂)与GABAA/BZ受体的亲和力。细胞试验表明,0.2～0.5 mmol/L的氨可剂量依赖性地诱发GABA(10-5M)介导的神经元Cl-内流,其原因可能是氨参与增强 GABA与GABAA受体的亲和力[12]。

用NH4Cl处理星形胶质细胞,可抑制GABA的摄取,同时增加GABA的释放[13]。氨的这种效应使细胞外的GABA浓度增加,从而激活GABAA受体。此外,如前所述,氨可以使PBR上调,PBR水平升高能促进神经类固醇激素的产生,而神经类固醇激素能上调GABAA受体密度,产生神经抑制作用。

2.6 氨引起Glu能系统神经的改变 与GABA神经递质相反,Glu是中枢神经系统的兴奋性神经递质。Glu受体分为两种主要类型:离子型谷氨酸受体(iGluR)和代谢型谷氨酸受体(mGluR)。iG1uR根据受体选择性激动剂的不同,可进一步分为 N-甲基-D-天冬氨酸(NM DA)受体、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异 恶 唑 (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepopionate,AMPA)受体和海人藻酸(kainate,KA)受体。

Monfort等总结高氨对Glu神经递质及其受体的影响:①氨可以引起Glu的释放和摄取改变,这种改变的结果导致细胞外间隙Glu浓度的增加,最终导致Glu受体的激活;②氨可以引起星形胶质细胞膜的谷氨酸转运体(GLT)表达降低;③高浓度的氨可以直接激活NMDA受体。NMDA受体激活后导致Ca2+的内流,Ca2+与钙调素结合,激活一氧化氮合酶(NOS),导致NO合成增多,NO可以激活鸟苷酸环化酶,最终导致细胞内cGM P浓度增加,引起进一步的细胞效应;④慢性长期中浓度的氨可以引起NMDA受体结合位点的降低,这可能是氨引起细胞间隙Glu浓度增高的代偿反应;⑤不同浓度和作用时间的氨对NMDA功能的直接作用不同。1 mmol/L的氨可以通过抑制蛋白激酶C(PKC)磷酸化,抑制NMDA受体的激活,而0.1 mmol/L的氨没有这种作用[14]。

2.7 氨引起的细胞信号传导通路的改变 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)与细胞膜表面的生长因子受体耦联,也可被细胞应激激活。M APK家族通过磷酸化作用激活酶、转录因子、结构蛋白以及其他细胞内信号因子,其成员包括ERK,p38-MAPK和JNK等。Jayakumar等观察到,用NH4Cl处理星形胶质细胞,可以激活MAPK通路,用抗氧化剂可以阻止这种激活效应,并且 MAPK通路阻滞剂可以使星形胶质肿胀的程度减轻[15]。

核转录因子(nuclear factor-kappa B,NF-κ B)是体内广泛存在的一种即早刻转录因子,通过激活细胞因子、细胞黏附分子、生长因子和免疫受体等的表达发挥作用。NF-κ B通常由P65和P50亚基以异源二聚体的方式与抑制分子I-κ Bα结合,存在于胞浆中。 当 I-κ Bα被磷酸化后,I-κ Bα与 NF-κ B分离,NF-κ B转位进入细胞核,刺激多种基因的转录。Sinke等发现5 mmol/L的 NH4Cl处理星形胶质细胞可以引起 NF-κ B转位的增加,而采用抗氧化酶、维生素E以及p38-MAPK的特异性抑制剂均可以降低 NF-κ B的转位,表明氧化应激、M APK信号通路参与氨引起的 NF-κ B激活[16]。NF-κ B的激活还可以促进诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的增加[17],进而促进一氧化氮(NO)的合成,后者可以导致星形胶质细胞肿胀。采用NF-κ B抑制剂BAY11-7082和 SN-50可以抑制氨引起的NO产生及细胞肿胀。

此外,氨还可以直接引起细胞内Ca2+浓度增加[18],激活细胞内Ca2+依赖性蛋白酶(如 NOS)产生自由基,促进 Glu释放等。

2.8 氨对水通道蛋白4表达的作用 水通道蛋白4(Aquaporin 4,AQP4)属于特异性的水通道蛋白家族成员之一。人类AQP4基因定位于染色体18q11.2和q12.1连接处,编码大约31 kDa和34 kDa两种蛋白异构体,两者在大脑均有表达,但前者主要存在于其他组织。AQP4在星形胶质细胞含量丰富,特别是在星形胶质细胞与皮质毛细血管相对应的终足部位。这种巧妙的定位说明AQP4对血脑屏障水的通透性调节具有特殊的作用。

Rama Rao等研究发现,用 5 mmol/L的 NH4Cl处理星形胶质细胞,10 h后就可观察到AQP4表达水平增加,并持续到48 h,细胞肿胀出现在给药12 h后[19]。相关分析结果表明,AQP4表达的增加与细胞肿胀之间存在相关性(r2=0.95)。进一步研究发现,CsA可剂量依赖性地抑制氨引起的AQP4表达增加,同时也能抑制氨引起的胶质细胞肿胀,说明线粒体MPT可能参与氨引起的AQP4表达增加[20]。此外,氧化应激、锰均参与AQP4表达调节[21]。

3 小结

氨可以通过引起能量代谢、氧化应激、线粒体MPT、GABA和Glu神经递质系统、细胞内信号转导以及 AQP4表达的改变,导致星形胶质细胞水肿,使星形胶质细胞对神经元的营养支持作用降低,这些因素综合作用的结果是产生HE。降氨、促进氨排泄治疗已是临床治疗HE的有效手段,明确氨在HE发病机制的作用,可为进一步开发抗氨毒性的HE治疗药物提供新的思路。

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