酶联免疫酶标法在临床中的应用

董韶伟 曹桂琴 赵丹华

河南省平顶山市平煤医疗集团一矿医院,河南 平顶山 467000

1 前言

近几年来,免疫学分析方法发展很快,特别是在使用标记抗原和抗体的分析技术以后,使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比,由于酶的高效生物催化作用,一个酶分子在数分钟可以催化几百个低分子发生反应,产生了放大作用,使得原来及微乎其微的抗原、抗体在数分钟就可以识别出来,这种技术被称为酶联免疫吸附试验法 (ELLSA法)。

ELLSA法是免疫诊断中的一项新技术,现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病,寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断,也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定。根据三年来的使用结果分析,认为ELLSA酶标法具有灵敏特异,简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点,不仅适用临床标本的检查,而且由于一天之内可以检查几百,甚至上千万标本。因此,也适合于血清流行病学调查,本法逼近可以用来检测抗体,而且也可应用于测定体液中的循环抗原,所以也是一种早诊断的方法。我院从 2006年元月至 2009年元月,用 ELLSA酶标法检测传染病总人数为 7890人,乙型肝炎患者为 758人,甲肝患者为 10人,丙肝患者为 35人,梅毒患者 19人。用ELLSA酶标法在生物医学领域的应用范围日益扩大。

2 测定抗体的种类方法原理

测定抗原体有四种方法：竞争法、双抗体 (抗原)夹心法、双位一步法、捕获法。竞争法原理：将特异抗体与固相载体连接,形成固相抗体,洗涤待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液;使之与固相抗体中含有抗原,则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合,竞争性地占去酶标抗原与固相载体结合的机会,使酶标抗原与固相载体的结合量减少,加底物显色,参考管中由于结合的酶标抗原最多,故颜色最深。参管颜色深度与待测管颜色深度之差,代表受检标本抗原的量,待测管颜色越淡,表示标本中抗原含量越多。

双抗体夹心法原理：将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体。洗涤出去结合的抗体及杂质。加受检标本,使之与固相抗体接触反应一段时间,让标本中的抗原与固相载体上的抗原结合,形成固相抗原结合物,洗涤除去其他未结合物质。加酶标抗体,使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗原结合,彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时,固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

双位点一步法原理：在双抗体夹心法测定抗原时,如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇单克隆,抗体分别作为固相抗体和酶标抗体,则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并成一步。

捕获法原理：将抗人 Igm抗体连接在固相载体上,形成固相抗人 Igm,洗涤、加入稀释的血清标本,保温反应后,血清中的Igm抗体被固相抗体捕获,洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分,加入特异性抗原试剂,这只与固相上的特异性 Igm结合,洗涤加入针对特异性的酶标抗体,使之与结合在固相上的抗原反应结合,加底物显色。如有颜色显示,则表示血清标本中的特异性 Igm抗体存在,是阳性反应。

3 判断方法

“+”或 “—”所有超过规定的 OD值的标本均属阳性,此规定OD值是根据事先测定的大量阴性标本所取得的,此规定是阴性标本的上限,或者以一组阴性标本 OD平均值加 2—3个标准作为阳性阈值。

直接以 OD值来表示如 0.4、0.7、1.2,OD值越大,阳性反应越强但此数值实在固定实验室条件下,得到的结果,而且每次实验都要有参考标本作对照。

以终点滴度表示,将标本作连续稀释,最高稀释度能出现阳性反应者 (即OD值仍大于阳性阈值,即为该标本的滴度)。以 “比值”表示,求出被检标本的 OD值的比值。例如：为阴性标本的 2倍或 3倍,即为阳性比值小于2.1或大于 1.5为疑,〈1.5为阴性。测定标本OD值 -空白OD值∕阴性对照 OD值 -空白 OD值 ＞2.1

4 ELLSA酶标法在临床的应用

ELLSA酶标法应用范围很广,而且正在不断扩大,原则上ELLSA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原,可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。在实际应用方面可作疾病的临床诊断,疾病监测,疾病普查等,因此,它和生物学免疫学、微生物学、流行病学及传染病学等方面,密切相关。检查抗原和半抗原方面,在内分泌方面,已经用于检测雌性激素,绒毛膜促性腺素、黄体素、胰岛素、皮质醇,促甲状腺和孕酮等。某敏感性与RIA相等。在肿瘤方面已试用检查甲胎蛋白 (AFP)癌胚抗原 (CEA)对前面的敏感性已达到与放射免疫水平相等等。

在传染病的诊断方面正在日益扩大,其中最满意的是用于检查乙型肝炎、甲肝、丙肝、梅毒、艾滋等。

[1]王颖,吕卓人,袁育康,张汉伟,等.酶联免疫吸附试验测定血清内源性哇巴因 [J].中华医学检验杂志,1998,35：763-764.