周围神经损伤后轴突再生的分子机制研究进展

高洁,刘良明,伍亚民

周围神经是连接中枢神经系统和外周靶组织器官信号通路的中介结构。周围神经损伤后,表现为神经元胞体的改变、神经纤维变性和微环境的改变,及靶组织器官的溃变。在损伤信号的传递中涉及损伤信号快速传导,并有相关转录因子、黏附分子、生长相关蛋白以及轴突再生的结构成分反应。成年哺乳动物的周围神经表现出旺盛的再生能力,而中枢轴突损伤,无论其胞体是否在中枢,一般情况下皆无法再生。从神经的发育看,神经轴突沿特定的路径延伸,到达将与它建立突触联系的靶细胞的胞体、树突或轴突。在神经突起末端存在一个扇形结构——生长锥(axonal growth cone),它表面的受体能选择性识别胞外环境中的导向信号,经过一系列信号转导机制引起自身的伸展和回缩反应,从而指导轴突生长[1-3]。当周围神经损伤后,神经纤维和周围结缔组织发生损伤反应,相应神经元依次发生神经元胞体肿胀,尼氏体消失,细胞核偏移,突触终端减少;远端轴突和靶组织器官发生华勒氏(Waller)变性而崩解,施万细胞增殖,胞体轴突产生生长锥,开始在多因素调控下的再生过程。破解轴突再生障碍的分子、细胞机理业已成为近来神经再生研究的重点。目前认为,决定周围神经轴突再生的策略主要包括:①神经轴突变性和再生信号通路的调控;②神经再生微环境的维持;③神经元轴突结构的构建。

1 周围神经损伤后的轴突反应及信号通路

周围神经损伤后,损伤神经局部主要产生3种明显的反应。

1.1 神经支配靶器官的逆行性传导受阻 神经生长因子(nerve growth factor,NGF)作为神经营养因子之一,从周围逆向运输至神经元胞体。坐骨神经损伤去轴突后,逆向运输减少到近1/10,虽然持续时间仅为48 h,呈3倍性减少并一直持续到再生发生。本实验室在研究大鼠坐骨神经损伤时发现,联合应用NGF和睫状神经生长因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)营养支持,对周围神经的轴浆运输功能的恢复优于NGF[4-5]。通过特异性抗体限制NGF内在活性可导致去轴突样变化;其他如 c-jun,神经肽,包括 galanin、血管活化性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、P物质、降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)和神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)等[6]也有类似作用。

1.2 施万细胞、炎性反应的分泌介质改变微环境 损伤轴突和靶组织及周围非神经细胞(如成纤维细胞)含有众多神经生长诱导和营养分子,包括CNTF、神经营养素3(neurotrophin-3,NT-3)以及成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors,FGFs)皆可于损伤后分泌。CN TF和核转录信号转导因子和转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription-3,STAT3),即活化后CNTF受体的下游靶点,都有广泛的信号调控作用。STAT3剔除可以增强伤后细胞死亡,提示STAT3具有神经营养性作用。敲除CNTF可延迟STAT3的磷酸化和神经细胞核转位[7]。施万细胞受损释放CNTF,并作用于邻近轴突局部,STAT轴突内磷酸化并逆向运输至损伤神经元胞体。后期,轴突损伤后白细胞募集,炎症细胞因子产生和邻近非神经细胞产生神经营养因子、趋化因子、胞外大分子和合成蛋白水解酶,损害轴突致胞外环境改变。继而是胞内信号分子活化,特别是控制细胞周期、分化、轴浆转运分子和细胞骨架成分合成,及各种生长因子和细胞因子的分泌,此外,还有调控能量、氨基酸和脂质代谢的分子[8-10]。

1.3 细胞电位平衡改变 损伤信号源相互协同或者分别作用活化核定位信号(nuclear localization signal,NLS)序列的轴浆蛋白,引发创伤信号扩布[11-13]。

除上述损伤神经局部发生病理反应外,相应的神经元会发生跨突触的变性,主要表现为神经元的变性坏死和/或凋亡。有研究证实,损伤神经细胞可出现包括fas和肿瘤坏死因子受体1和2(tumor necrosis factor receptors 1,2,TNFR-1,2)。除了TNFR-2,受体携带一种胞浆死亡区域,这种区域可以通过fas相关死亡结构蛋白(fas-assocaiated protein domain,FADD)释放一种促凋亡信号。调控FADD可通过fas和TNFR去除后的细胞死亡信号。此外,实验研究还发现,敲除Bax或抑制细胞凋亡蛋白酶3(caspase-3)或者caspases整个家族,可以阻止细胞死亡,多种caspase抑制因子中唯caspase-3作用强而持久。尽管目前的研究还有争议,但总体而言,TNF及其受体、促凋亡的caspase-3等因素对周围神经损伤后的跨神经元变性坏死和/或凋亡具有重要作用。下位靶组织器官也发生相应的溃变,一般认为,其机制与此类似。

轴突损伤后,除产生上述变性反应外,随后也产生再生性改变,在形态上表现为生长锥的形成,相应神经元胞体及近端轴突合成代谢增强,如多胺生成酶(鸟氨酸谷胺酰转胺脱羧酶)暂时上调,从而使腐胺、精胺、亚精胺促进在体和离体轴突生长[14]。丝裂原活化蛋白(mitogen-associated protein,M AP)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)级联反应抑制 Raf、Ras、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-associated protein kinase kinase,MEK)、胞外信号调节激酶1和2(extracellular signal-regulated kinase 1,2,Erk1,2)等信号分子均参与了上述再生性反应[15],Ras/Raf/MEK-PI3K信号通路被认为具有十分重要作用[16-17]。无论周围神经损伤引起的变性改变还是随后的再生性反应,都离不开神经元相应的基因表达变化,目前认为其最终影响核转录因子的表达及活性,包括转录因子的磷酸化和核转位,这些转录因子主要包括 c-jun、junD、激活性转录因子 2、3(activating transcription factor,ATF)、P311、Sox11、STAT3 以及 islet-1、核因子κ B等,可能存在调控再生神经元基因表达的开关信号[18]。

2 周围神经轴突的再生微环境及重要调控分子

正常神经元胞体及其轴突结构和功能由稳定的微环境来保障和维持。神经损伤后,周围神经纤维内环境随之变化,各种局部因素,包括神经膜细胞、巨噬细胞等重要的细胞成分,以及由各种细胞表达和分泌的众多具有生物活性分子炎性介质、黏附分子和神经营养因子等对轴突再生、趋化生长、髓鞘再形成和突触重建调控具有一定作用。

2.1 炎性分子 轴突损伤后,神经远端和损伤神经元胞体周围发生急性炎症反应,表现为以白细胞为主的炎性细胞迁入,以协助清除胞体周围变性坏死的施万细胞及髓鞘碎片。这些局灶性炎症细胞很快被激活,移入后直接接触胞体,与监测损伤神经组织的T细胞相互作用。巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,MCSF)缺乏导致小胶质细胞增生以及早期淋巴细胞重新募集减少,但不影响轴突再生速度;同样,基因变异小鼠轴突损伤后,敲除神经营养因子受体P75NTR或者含SH结合域的酪氨酸蛋白磷酸化酶(SH-domain-containing protein tyrosine phosphates,SHP-1)可见炎性反应增强,无神经再生现象[19]。然而,一些研究显示轻度正相关。

白细胞介素(IL)-6基因敲除明显减少运动神经元去轴突后的炎症反应,但也引起轴突再生速度的轻度下降。IL-6和其受体联合过度表达导致神经再生增强;反之,面神经压迫性损伤时,通过细胞形态学测定发现,遗传性IL-6基因缺乏导致轴突再生速度减少15%,与坐骨神经压迫损伤后的功能性行走实验测定结果类似[14]。与周围神经系统相比,IL-6对中枢的作用争议很大。IL-6缺乏被认为可减少面运动核损伤模型中胶质疤痕形成,提高中枢轴突发芽;可加快脊髓损伤后的功能恢复,但条件性损伤诱导的脊髓轴突再生下降。这些研究提示,由炎性细胞和炎性因子介导的炎症反应对中枢神经和周围神经损伤后的再生微环境的调控可能具有不同的作用及不同的分子机制。

2.2 黏附分子 在神经系统发育过程中,细胞黏附分子(cell adhesion molecule,CAM)是介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间相互识别、黏附和信号传导的重要信号分子。最近的在体研究比较关注层粘连蛋白α 7β1整合素受体和半乳糖凝集素(galectin)的作用。研究显示,敲除编码α 7整合素亚单位基因导致面神经轴突切割后运动轴突再生速度下降及周围神经靶点重新支配约40%。同样,jun基因缺陷小鼠损伤后,α 7并不上调,这似乎与这些动物轴突再生反应较弱有关。缺乏层粘连蛋白,即α 7整合素的配体会产生同样但更显著而持久的作用。γ 1层粘连蛋白链细胞的特异基因缺乏,即周围神经施万细胞中α、β、γ三联体必要成分的缺乏,导致坐骨神经压迫损害后进入末梢神经轴突的成分大量减少,持续 30 d;而α 7缺陷动物末梢神经轴突成分呈暂时性缺少。研究还注意到,α 7缺陷小鼠神经损伤后,β整合素上调非常显著,与中枢轴突发芽明显增长相对应。损伤诱导的神经轴突发芽后,细胞黏附分子如免疫球蛋白超家族成员 L1(l immunoglobulin-1,L1)和其高同源体(close homologue of L1,CHL1)与β 1整合素功能相关[20],而且可能与α 7缺陷小鼠在损伤中作用相同。

各种黏附分子包括整合素、半乳糖凝集素/CD46、67 kDa层粘连蛋白受体、细胞外基质受体α-dystroglycan(α-DG)1,4半乳糖转化酶可能作为不同受体的配体过量表达。比如应用外源性galetin-1可以提高神经突生长速度;以抗体中和内源性galetin使其失效或者基因敲除降低速度。氧化型galetin-1也可刺激施万细胞由近端向远处残端迁移,辅助桥接细胞,促进轴突向损伤神经末梢长入[21],提示其可能在周围神经损伤后的轴突的生长、突触的可塑性、神经纤维的成束发挥有意义的作用。

2.3 神经营养因子 很多研究已表明神经营养因子有一定的保护作用[22]。但也有一些研究证实,应用神经营养因子减少细胞存活。王永堂注意到,NGF毒性作用依赖于普通神经营养因子受体P75NTR。同样,P75NTR的毒性作用也见于坐骨神经轴突再生[19],但未见于面运动神经。应用不同神经营养因子、生长因子和细胞因子已显示出促进轴突跨越断端空间的远端和近端轴突生长。

影响神经末梢轴突再生速度主要是3组因子:①胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor-1,IGF-1);②神经营养因子(neurotrophic factors,NTFs),包括脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、转化生长因子(transforming growth factor,TGF)超家族成员、胶质细胞源性神经营养因子(glial-cell derived neurotrophic factor,GDNF);③白血病抑制因子(LIF)。应用增强型外源性生长因子IGF-1、IGF-2和抗体可减少轴突再生速度。我们课题组观察到,大鼠坐骨神经损伤后以IGF-1配合几丁糖,伤后1个月治疗组感觉功能恢复明显(实验资料整理中)。文献报道,当BDNF和GDNF在周围神经损伤末梢被活跃诱导时,去轴突的神经元受体表达随着慢性离断过程逐渐减少。应用BDNF和GDNF不能使损伤后轴突很快再生,却可提高损伤后慢性去轴突的运动神经元轴突再生,BDNF/GDNF量如果不足可能导致慢性去轴突效应[23]。抑制内源性BDNF和GDNF也减少轴突损伤后周围神经再生。

3 神经元轴突再生骨架结构的重建

细胞骨架成分的合成和转运是神经生长锥形成和延伸的重要条件。神经损伤后再生也面临骨架成分的变化,轴突完全再生常伴随大量功能各异的分子家族出现,以调控细胞表面相互作用。生长相关蛋白43(growth associated protein-43,GAP-43)、丙氨酸烷化C激酶基质(myristoylated alanine rich C kinase substrate,ARCKS)、皮质细胞骨架伴随蛋白 23(cortical cytoskeleton-associated protein,CAP-23)与磷酸共同分布于细胞表面的raft区域。这些分子结构多变,只结合于磷脂酸如PI-(4,5)-P2、钙/钙调节蛋白、蛋白激酶C和肌丝蛋白,并调节raft重新募集信号分子如非受体类酪氨酸激酶(sarcoma kinase,Src),调节肌动蛋白细胞骨架聚合、再分布和降解。钙调节蛋白含钙和不含钙成分与上述分子相互作用,对于受体介导的钙内流调控生长锥的活性有重要的连接作用;以尼莫地平抑制钙内流可明显增加轴突再生。神经损伤后,微管降解分子如SCG10、微管调控蛋白 stathmin、视网膜母细胞瘤蛋白3(retinoblastoma protein-3,RB3)和相关配合物皆是生长锥发育相关蛋白[22],例如萎陷反应诱导蛋白-2(collapsin response protein-2,CRMP-2),形成第2个轴突适应分子微管靶向群,在神经损伤后表达上调。CRMP-2神经过度表达可改善轴突再生[9]。微管相关蛋白1b(microtubule associated protein 1b,MAP1b)业已证实可直接介导感觉神经元再生时定向性生长锥迁移和轴突分枝。

在调节细胞骨架结构、动力学和细胞黏附等方面需要关注Rho GTP酶,其主要成员为 RhoA、Rac、Cdc42和 TC10,可作为分子开关调节细胞骨架再生构建[3]。GTP酶的活化是由与细胞表面受体连接的适应分子,如导向迁移分子slit-robo GTP酶活化酶蛋白 2介导。轴突损伤致 RhoA、Rac、Cdc42轻度上调和TC10的大幅增加。在体RhoA抑制激发中枢无轴突再生的正常诱导过程[1,4]。周期素依赖性激酶抑制剂 P21(Cip1/WAF1)与Rho激酶结合为复合体并抑制其活性,也促进中枢神经系统损伤后再生和功能恢复。促进P21表达的分子如核蛋白P311,也促进损伤运动神经再生,加速周围神经靶点再分布[9]。并非每个周期素依赖性激酶都抑制再生,可能存在周围神经损伤病灶轴突再生延长的屏障。

4 结论

研究周围神经损伤后的损伤反应和成功再生反应的信号分子,重点探讨相关信号通路及其调控机制,将有助于揭示促进轴突再生的内源性分子作用机制。目前开展的关于P75NTR和神经营养分子的系列研究结果提示,从分子信号通路入手有可能帮助我们解析修复损伤的周围神经乃至中枢神经系统的复杂过程。

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