自噬体的检测及其对肿瘤的作用

齐亚莉,王 俊,李 岩,王洪艳,龚守良

(1.吉林大学公共卫生学院卫生部放射生物学重点实验室,吉林长春130021;2.北华大学公共卫生学院,吉林 132001;3.吉林市肿瘤医院放疗科,吉林 132001)

1 自噬的概述

1.1 自噬(autophagy)简介 自噬来源于希腊词汇,意思是“self”和“eating” ,用来描述细胞在饥饿时,为了存活而降解细胞内成分获得营养。自噬是真核细胞蛋白降解的重要途径,其作用主要是清除降解细胞内受损伤的细胞结构、衰老的细胞器及不再需要的生物大分子等,同时也为细胞内细胞器的构建提供原料,即细胞结构的再循环。细胞对这种合成与降解的精细调节,对维持细胞的自身稳态有重要意义。

1.2 自噬的发生过程 自噬开始于细胞质内半环状双层或多层膜结构的形成,进而包绕大量细胞质和细胞器(如线粒体、内吞体、过氧化物酶体等),形成自噬体(autophagosome),其直径一般为300-900 nm,平均500 nm。包裹膜可能源于粗面内质网的无核糖区、反面高尔基网络或其它有膜囊泡体。自噬体膜相关蛋白的缺乏是从酵母到哺乳动物的共同特征,故难以确定自噬体膜的起源。自噬体与溶酶体融合,成为自噬溶酶体(autophagolysosome),最终通过溶酶体内的蛋白酶降解其内成分,完成对包裹物质的降解和再循环利用。

1.3 自噬分类 根据细胞物质运到溶酶体内的途径不同,自噬可分为以下3类。

1.3.1 大自噬 多数人认为是由内质网来源的单层膜凹陷形成杯状双层膜样的分隔膜,进而完全包绕待降解物形成自噬体,接着与溶酶体融合,自噬体内细胞物质(如细胞器)被溶酶体酶溶解。

1.3.2 小自噬 小自噬是溶酶体的膜直接包裹如长寿命蛋白并在溶酶体内降解。

1.3.3 分子伴侣介导的自噬(CMA)胞浆内蛋白结合到分子伴侣后被转运到溶酶体腔中被溶酶体酶消化。CMA的底物是可溶的蛋白分子,所以CMA降解途径在清除蛋白质时有选择性,而前二者无明显的选择性。

1.4 自噬主要有3种作用

1.4.1 自噬是对营养缺乏的一种适应性反应,如氨基酸缺乏在肝脏和培养细胞中可以诱导自噬。自噬对大分子物质的降解能够产生调节新陈代谢和生物合成的氨基酸及其它因子,为细胞提供能量,维持细胞的生命活动。氨基酸是自噬的重要调节因子,缺失氨基酸在肝脏中迅速诱导自噬,最初可观察到自噬体,经历7-8 min后降解液泡出现。从自噬体的形成到转化成残余体这一完整自噬进程约需20 min,营养缺乏的肝细胞中自噬途径对胞质蛋白这种非选择性的降解率为3%-4%/h[1]。

1.4.2 自噬能够调节过氧化物酶体、线粒体和内质网的更新,故自噬被认为是一种参与细胞质稳态的看家机制,在许多病理生理和应激刺激状况下可观察到对这些细胞器选择性的分隔。

1.4.3 自噬参与特定的组织特异性功能。自噬与肺泡表面活性剂Ⅱ生物合成有关。黑质多巴胺能神经元神经黑色素的生物合成应归于胞质多巴胺-苯醌被分隔入自噬液泡。在红细胞成熟过程中,细胞核排出后需要自噬清除核糖体和线粒体等细胞器。

1.5 自噬的发生过程可分为4个阶段

1.5.1 启动阶段 启动阶段是隔离膜形成的阶段。在饥饿及某些激素等因素刺激下,有双层膜的杯状分隔膜开始在被降解物的周围形成。

1.5.2 延长阶段 此阶段即隔离膜弯曲、变大,形成吞噬体膜以包裹吞噬的成分。

1.5.3 成熟阶段 在此阶段,自噬体形成之初,胞质与核质变暗,但细胞核结构无明显变化,可见线粒体和内质网膨胀,高尔基体增大,胞膜特化结构(如微绒毛、连接复合物等)消失,胞膜发泡并可出现内陷。自噬后期,自噬体的体积和数量都有所增加,其内常充满髓脂或液体,胞质中可见灰白成分,少数可见核固缩。

1.5.4 自噬体的裂解 自噬体形成后,将其包裹物运输至溶酶体内与溶酶体融合形成自噬溶酶体,这一过程并非简单的扩散,而是通过细胞骨架微管网络系统的传输实现的。自噬体融合后,最终被溶酶体中的水解酶溶解,首先经过囊泡酸化,达到所需pH值后经多种蛋白酶作用使囊内容物降解,降解产物在细胞内再循环利用。

1.6 自噬体的检测

1.6.1 以透射电子显微镜下超微结构的形态学检测(俗称检测自噬体的金标准)。在透射电子显微镜下可见损伤的细胞器如线粒体的肿胀变性,其周围出现空泡状双层膜样结构,继而双层膜环绕成自噬体,进而与溶酶体融合、消化;也可见自噬溶酶体内最终不能降解的残体等[2]。

1.6.2 自噬体膜标志性蛋白质的检测。自噬体膜上标志性蛋白质有Atg12与Atg5结合体和微管相关蛋白1的轻链3(LC3)。Atg12和Atg5在翻译后就像单个分子一样共价结合在一起,定位在自噬体双层隔离膜的整个延长阶段。LC3是酵母菌自噬基因(Apg7/Apg8)在哺乳动物中的同源物,和前者相比,LC3除了定位在自噬体分隔膜上,也一直以和磷脂酰乙醇胺即脑磷脂(PE)结合的形式(LC3-PE)存在于自噬体形成各阶段的内外膜上,在自噬溶酶体膜上也可见[3]。通过与绿色荧光蛋白(GFP)结合成Atg12-Atg5-GFP、LC3-GFP,即可实现对自噬体的检测。LC3是目前检测自噬的唯一标志蛋白,有两型,LC3-Ⅰ分子量为18 kDa,LC3-Ⅱ分子量为16 kDa,可检测其含量和比值以反映细胞自噬活性。

1.6.3 单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法。此法是自噬发生过程中分析分子水平机制的一种特异的检测自噬体方法[4]。自噬体形成依赖的第二个泛素样结合系统(Atg8)是位于自噬囊泡膜上与MDC特异结合的生化标志,通过荧光染色,在荧光显微镜下可见核周区域阳性显色。

1.6.4 应用LC3-Ⅱ/DNA双参数流式细胞术对细胞自噬与细胞周期进行同步分析,既可以检测细胞自噬的发生,又可以与细胞周期进行同步分析,阐明细胞自噬的发生与细胞周期的关系,同时也建立了一种新的检测自噬的方法[5]。

1.6.5 间接自噬体检测法。自噬溶酶体及其不能降解的产物残体的检测。自噬体和溶酶体融合后,除上述的LC3-GFP法检测外,还有吖啶橙染色法,是一种荧光染料作为非极性反胶态分子团的分子探针,在自噬溶酶体内酸性磷酸酶活性增强下显著着色。对残体的检测主要是对脂褐素颗粒的显微观察。

2 自噬在肿瘤中的作用

2.1 肿瘤细胞中自噬活性的降低 在对不同肿瘤细胞发展过程的研究中发现,有些肿瘤细胞,如化学致癌物导致的肝癌细胞,在癌变前期的肝结节时就已经出现了自噬能力下降的现象;而鼠的胰腺细胞经致癌物质诱导后,在癌变前期的结节和形成腺瘤时自噬和降解能力增加,当形成癌细胞时自噬能力反而减少[6]。这些例子说明,大多数肿瘤细胞(如肝脏、胰腺和乳腺癌等)尽管癌变前自噬能力各有不同,但是在癌变之后其自噬能力均减弱。自噬能力的衰退可能有利于肿瘤的发展。这提示,肿瘤细胞能快速生长,是由于其打破了细胞蛋白质合成速率与自噬体降解蛋白质的平衡[7]。

2.2 肿瘤细胞中的高自噬活性 尽管大多数肿瘤细胞的自噬活性都降低,但是仍然有一些肿瘤细胞保持了较高的自噬活性,如大肠癌、肺癌细胞及人宫颈癌HeLa细胞等。研究表明,在缺乏血清或氨基酸的情况下约3 h,HeLa细胞中的自噬部分从4%上升到37%。这些肿瘤细胞所具有的高自噬活性对肿瘤细胞在恶劣环境中的生存起到了一定的保护作用,也可能使一些肿瘤药物的作用减弱[8]。

2.3 自噬可作为肿瘤抑制因子 抑制自噬可使蛋白降解减少,合成代谢增加,导致癌前病变细胞的持续性生长。与相应正常细胞相比,肿瘤细胞和转化细胞自噬能力明显下降,例如,转化的成纤维细胞蛋白降解速率低于未转化者,特别是在营养和(或)血清缺失的状况下。在致瘤动物实验中也观察到自噬能力的下降,二乙基亚硝胺诱导的原发性肝癌,癌前结节自噬能力较正常肝细胞下降,正常肝细胞经种植瘤大鼠腹水作用后,自噬性蛋白降解被完全抑制。而且,从肝结节和肝细胞肝癌中分离出的细胞在培养中较正常肝细胞在氨基酸缺失的状况下存活良好。根据这些资料,Schwarze等[9]提出自噬下调导致生存优势是因饥饿而防止蛋白过度丢失,蛋白平衡提高的结果。在体内,相较于正常肝细胞,在氨基酸浓度波动的饥饿应激下,通过降低自噬维持正蛋白平衡能够使癌前病变细胞获得克隆优势。

2.4 保护肿瘤细胞的作用 自噬除了抑制肿瘤的作用外,作为细胞的保护机制之一,还具有保护肿瘤细胞的作用。例如,使用 100 μ mol/L替莫唑胺(temozolomide)处理恶性胶质瘤细胞U3732MG,3 d后可以看到细胞中有明显的自噬特征性改变,而且细胞的增殖受到抑制,但作用7 d后却发现细胞开始增殖[10]。这说明,替莫唑胺诱导的自噬是可逆的,而且这种自噬可以保护肿瘤细胞,防止其死亡。Yan等[11]研究了响尾蛇对白血病K-562细胞的作用,发现自噬可以延缓凋亡,维持细胞活力。Paglin等[12]发现,结肠癌、乳腺癌及前列腺癌细胞在接受小剂量放疗后,均存在酸性囊泡样细胞器(AVO,即自噬泡)堆积现象。事实上AVO是保护照射后细胞的一种防御机制,因为抑制AVO后,辐照细胞的死亡率升高。有人推测,自噬是凋亡的早期反应,当细胞的损伤超过自噬保护负荷后,线粒体的准凋亡因子将激活细胞死亡程序,因此提高自噬能力可减轻或者避免因凋亡所引起的死亡。

2.5 双重作用 由此可见,自噬在肿瘤中的作用是双重的,作为肿瘤保护机制,自噬可以保护癌细胞免受药物的攻击;作为肿瘤抑制机制,自噬可以导致细胞死亡、限制细胞数量,或者减少DNA的突变概率,以防止肿瘤形成。

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