甘草黄酮类化合物提取分离的研究进展

朱菊花

（甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730000）

甘草为豆科多年生草本植物，以根和根茎入药，具有补脾益气、清热解毒、润肺止咳、缓急止痛、调和诸药的功效[1]。黄酮类化合物为甘草的主要有效成分之一，是一类具有C6—C3—C6基本母核的生物活性较强的天然产物。迄今已从甘草中分离鉴定出300多个黄酮类化合物，其中给出结构和名称的有150多个。甘草黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗心律失常、抗溃疡、保肝、解痉、抗菌、抗炎和抗变态反应、抗氧化、酶抑制、调血脂、镇痛、镇咳祛痰等多种生物活性[2-3]，被广泛应用于医药、保健及美容等行业。有研究表明，甘草黄酮具有抗艾滋病病毒的活性[4]，因而使甘草黄酮类天然产物成为国内外新药研究和开发的热点。现有的甘草黄酮提取分离方法很多，基本原理都是通过物理、化学方法破坏甘草的细胞壁，再根据甘草黄酮的极性及溶解性能的差异来达到提取分离的目的。现将提取方法和分离方法分述如下。

1 提取方法

1.1 水提法

水提取主要为碱性溶剂提取。但建明等[5]以氢氧化钠水溶液为提取剂提取甘草渣中黄酮类化合物，结果表明最佳提取工艺是氢氧化钠的浓度为0.2mol/L，甘草渣与提取剂之比为1∶14，提取温度90℃，提取时间0.5h。使用碱性溶剂提取具有试剂价廉易得、提取工艺简单易控制等特点，但该法存在提取杂质多、提取液存放易腐败变质、后续处理烦琐等缺点，现已不常使用。

1.2 有机溶剂提取法

有机溶剂提取法是目前应用最多、工艺较成熟的技术，通常是将甘草及甘草渣用乙醇、甲醇等有机溶剂冷浸[6]、加热回流[7]提取，提取液中加入石油醚以除去脂质，再分别用二氯甲烷、乙醚、丙酮、正丁醇进行提取或用碱酸处理和用大孔树脂处理得到含量和收率较高的甘草黄酮类化合物[7-8]。但采用有机溶剂提取所得产物的有效成分质量分数不高，杂质较多，大量有机溶剂的使用也增加了后续处理的困难，且会对环境造成污染。

1.3 超声波提取法

随着现代科学技术的发展，超声技术已广泛应用于中草药有效成分的提取[9]。超声波能破坏植物的细胞，从而加速药材有效成分在溶剂中的溶解，缩短提取时间，提高有效成分的提出率，为中草药成分的提取提供了一种快速、高效的新方法。李炳奇等[10]采用超声技术对甘草中黄酮和甘草酸进行联合提取，确定了影响提取效果的主要因素，摸索出一套合适的甘草酸和黄酮的提取方法，并通过正交试验得出影响黄酮提取效果的因素大小顺序为提取温度、超声功率、固液比、提取时间，最佳提取条件为超声功率1 000W，超声时间75min，提取温度40℃、固液比1∶8。刘红等[11]研究了超声条件下不同提取时间对甘草黄酮提取率的影响，结果表明在室温下超声提取80min较合适。王应强等[12]比较了水提取、乙醇回流提取和超声提取3种提取方法，结果表明超声提取法优于乙醇回流法和水提取法。葛淑俊等[13]采用超声波提取技术对甘草离体培养物中总黄酮提取和测定工艺进行优化，以建立在室内筛选高产细胞系和试管苗株系的方法，结果表明该工艺准确度较高、稳定性好、简便可行，为优良细胞系的筛选和试管苗的早期鉴定奠定了技术基础。超声波提取法因省时、节能、提取率高等，而在甘草黄酮类成分的提取中显示出一定的优势。

1.4 微波辅助提取法

微波辅助提取法是基于物质的介电性质和物质的内部不同电荷极化不具备跟上交变电场的能力而实现的。微波可直接作用于分子，使分子热运动加剧，从而引起温度升高，这种热效应使其穿透到介质内部，快速破坏细胞壁，使中草药有效成分更快地分离提取出来[14]。张梦军等[14]采用微波辅助提取法和水提法进行了甘草黄酮提取的对比研究，并利用均匀设计寻找微波辅助提取甘草黄酮的最佳条件，通过试验发现微波辅助提取法的提取效率明显优于水提法。阚微娜等[15]利用微波提取技术研究了微波提取溶剂、微波功率、辐照时间、液固比、甘草原料、提取次数对甘草酸和甘草黄酮同时提取的影响，达到了获取两种有效成分最大提取率的目的，确定了最佳的提取工艺路线，既缩短了甘草中有效成分的提取时间，又提高了药材的综合利用率。采用超声-微波协同萃取法从甘草中提取黄酮，可使样品介质内各点受到的作用一致，降低目标物与样品基体的结合力，加速目标物从固相进入溶剂的过程，具有省时、节能、提取率高等优点，可作为甘草黄酮的提取方法之一[16]。

1.5 复合酶提取法

复合酶法利用酶解作用破坏细胞壁结构，使其提取结构阻力减少，利于中药有效成分的提取。此法采用生物降解技术，是一种安全、有效、对环境无污染的提取方法[17]。高保英等[18]通过试验对复合酶法及微波法进行了比较，结果以纤维素酶、果胶酶组成的复合酶法提取率与微波法相当，但复合酶法仅以水为溶剂，在温和的反应温度下即可达到微波提取的效果，且提取成本及耗能均较微波法低。王芸芸等[17]采用纤维素酶和果胶酶对甘草渣进行酶解，从中提取甘草总黄酮，并与常规醇提法进行比较，结果复合酶法提取的游离总黄酮含量提高了1.15倍。复合酶提取法的不足之处在于提取时间较长，但其提取条件温和、操作简单，克服了活性成分在高温下易分解破坏的缺点，且无污染，对生产设备没有特殊要求，可作为提取甘草黄酮的一种新方法，值得进一步推广应用。

1.6 超临界二氧化碳（CO2）萃取法

超临界CO2萃取法是20世纪60年代兴起的一种新型分离技术，清洁、高效、选择性较好，对环境无污染。超临界CO2萃取主要受压力、萃取时间、温度、CO2流量、原料粒度及夹带剂的影响。付玉杰等[19]以萃取温度、萃取压力、夹带剂用量、CO2流量、分离压力及分离温度为指标，确定超临界CO2萃取甘草黄酮的最佳工艺条件，并以此最佳工艺与常规溶剂法（乙醇提取）进行比较，结果表明，超临界CO2萃取法的甘草粗黄酮提取率比常规溶剂法高2.2倍。此后，付玉杰等[20]又对甘草地上部分（茎叶）的超临界CO2提取工艺进行了研究，考察了压力、萃取时间、温度及CO2流量对甘草地上部分总黄酮提取率的影响，结果表明，超临界CO2萃取甘草总黄酮的工艺具有提取率高、纯度高、溶剂用量少、提取时间短、提取率高和活性成分不易分解破坏的优点，符合我国中药现代化的发展方向，为工业化超临界CO2萃取法生产甘草黄酮提供了研究基础。

1.7 闪式提取法

闪式提取法是将生物组织加入到提取溶剂中进行高速组织匀浆，以提取组织中有效成分。邓引梅等[21]对比研究了闪式提取、索氏抽提、搅拌提取、超声波提取对胀果甘草叶总黄酮的提取效果，并利用正交试验对总黄酮的闪式提取工艺进行了优化。结果表明，闪式提取法与其他提取方法相比，具有提取率高、提取时间短、溶剂用量少、成本低等优点。此后，邓引梅等[22]又在单因素试验基础上探索了用响应面法确定闪式提取甘草叶中总黄酮的最优提取工艺参数的可行性，表明闪式提取法是一种高效、快速的提取方法。闪式提取法为提取甘草黄酮提供了一种新方法，同时也为其他天然产物有效成分的提取提供了可靠的借鉴方法。

1.8 半仿生提取法

半仿生提取法（SBE法）是将整体药物研究法与分子药物研究法相结合，从生物药剂学的角度为经消化道给药的中药制剂创立的一种提取新技术[23]。它模拟口服给药及药物经胃肠道转运的过程，采用一定pH的酸水和碱水依次连续提取，提取液分别滤过、浓缩，制成制剂[24]。目前应用此法研究甘草黄酮提取的不多见，程艳芹等[25]采用均匀设计法以甘草酸含量、总黄酮、总多糖、高效液相色谱总面积、干浸膏得率为指标，对甘草的SBE法工艺条件进行优选，并结合工业生产实际，确定最佳工艺条件为三煎用水的pH依次为6.0，7.5，9.0，煎煮时间依次为2，1，1h。此法适合于工业化生产，体现中医药治病系综合成分作用的特点，有利于用单体成分控制制剂质量，值得做进一步的工艺研究与推广应用。

2 分离技术

甘草总黄酮化合物的分离方法主要有树脂吸附法、色谱联用技术、溶剂萃取法、萃取-柱层析结合分离法等，常用的为前两种方法。田庆来等[26]采用溶剂萃取法实现了甘草浸提液中水溶性黄酮和甘草酸的分离，但此法萃取不完全，所得甘草黄酮的纯度不高，因而应用不多。张宇等[27]利用萃取、柱层析相结合的方法提高目标物甘草苷的含量达到90％以上。色谱联用技术多用于中草药单体成分的分离及结构鉴定，日本学者[28-30]就应用色谱技术从甘草浸膏、甘草毛根培养物中提取分离得到多种甘草黄酮类化合物。树脂吸附法是将中药水提液、醇提液直接或经浓缩得浸膏后溶解于溶剂中，再上大孔树脂柱，以适当溶剂洗脱并收集，从而对中药有效成分达到提取分离，近年来广泛应用于天然产物的提取分离，根据孔径、比表面及构成类型分为多种类型。经试验[31-32]筛选得出AB-8型大孔吸附树脂对甘草总黄酮具有良好的分离纯化效果，纯度大于50％，符合有效部位研究的要求。另有研究表明[33]，HP-20大孔吸附树脂能有效提取甘草中的黄酮类成分，一次分离可使黄酮含量达到53.46％，进一步经聚酰胺树脂柱色谱纯化后，甘草黄酮含量可达到90.26％。这些分离技术为进一步分离甘草总黄酮的研究奠定了基础。

3 小结

甘草黄酮作为一类生物活性较强的成分，应用广泛，市场需求日益强劲，促使其提取分离技术得以较快发展。目前应用较多的水提法及溶剂提取法，虽工艺较成熟，但提取效率低，能耗大，后续处理烦琐。超声提取、微波提取以及超声-微波协同萃取具有缩短提取时间、提高有效成分提出率的优点，但多用于实验室研究。闪氏提取作为一种高效的提取新技术，仍需进行进一步的研究论证。半仿生提取体现了中医治病综合成分作用的特点，适合于工业化生产，值得做进一步的工艺研究。复合酶提取技术具有提取条件温和、操作简单、对生产设备没有特殊要求等优点，超临界CO2萃取技术具有溶剂用量少、提取时间短、提取率高和含量高的优点，且两种技术均具有安全、不污染环境的特点，符合我国中药现代化的发展要求，可作为甘草黄酮类化合物工业化生产的发展方向。色谱联用技术、大孔吸附树脂技术对于甘草黄酮类化合物具有较好的提取分离纯化效果，但还存在进样量少、耗时长、有机溶剂用量大等问题，使对于甘草黄酮类化合物的开发多限于粗制品，价值较低。因此，选用先进的提取分离技术，特别是加速寻找甘草黄酮类化合物单一成分的提取分离方法，才能更加合理有效地利用甘草资源。

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