内生多粘类芽胞杆菌纤溶酶基因PPFE-I在大肠杆菌中融合表达及活性分析

吕凤霞，陆兆新，别小妹，林谦，张充，曹林，郭瑶，汤彦翀

南京农业大学食品科技学院 酶工程研究室，南京 210095

血栓栓塞性疾病严重危害人类健康和生命，溶栓疗法是治疗血栓栓塞性疾病最为有效并且可靠的手段。溶栓疗法主要是通过药物溶解血栓中的主要基质血纤维蛋白，或激活血液中无活性的血浆纤溶酶原，形成有活性的纤溶酶来催化血纤维蛋白的水解，使血栓溶解，血管再通。目前临床应用的溶栓药物有较好的疗效，明显降低了患者的死亡率和致残率，但还存在特异性不高、半衰期短、易出血及再栓塞等缺点。因此迫切需要研制开发高效、特异、安全、副作用小、价廉的新型溶栓药物。已有研究表明，许多中药具有抗血小板聚集、抗血栓形成的作用，包括生物碱类、黄酮类以及皂甙等化合物[1]，尤其是活血化瘀中草药具有不同程度的抗凝血、血小板聚集及溶解血栓的作用[2-5]。生活在植物组织内的内生菌，由于内生菌与宿主植物长期协同进化过程中，彼此构成了稳定的生态关系，使内生菌具有产生某些与植物相同或相似化合物的能力[6]。因此，从植物内生菌的代谢产物中寻找新型溶栓剂具有深远理论意义和潜在的应用价值。目前，关于内生菌来源纤溶酶的研究报道尚不多见。

本研究室首次从中药植物组织中筛选分离到一株纤溶活性较高和良好体外溶栓效果的多粘类芽胞杆菌EJS-3[7]。由于从天然产酶菌株中分离纤溶酶不仅产量低而且酶的分离纯化过程操作繁琐，可采用基因工程技术在大肠杆菌表达系统中高效表达纤溶酶，进一步提高酶的产量，简化纯化过程。

本研究采用PCR方法克隆了内生菌多粘类芽胞杆菌纤溶酶PPFE-I，构建了pET-DsbA/PPFE-I融合表达载体，将其转化Escherichia coli BL21 (DE3) 后获得可溶性表达，实现了在大肠杆菌中有活性的表达，并对表达产物进行分离纯化研究，为利用基因工程技术在原核系统中高效表达纤溶酶提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

产纤溶酶芽胞杆菌 EJS-3为本室从植物内生菌中分离并保存，经鉴定为多粘类芽胞杆菌Paenibacillus polymyxa；E. coli TOP10F'及 E. coli BL21(DE3) plysS为本室保存。表达载体pET-DsbA为深圳市勤宝升生物技术开发公司产品。

1.1.2 工具酶和化学试剂

限制性内切酶BamH I、Bcu I、T4 DNA连接酶购自Fermentas公司；高保真DNA聚合酶Pfu、基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒购自上海Sangon公司；Western blotting化学发光系统为Amersham公司产品；HRP标记的羊抗鼠 IgG 二抗购自 Santa CruZ Biotechnology 公司；PVDF (polyvinylidene fluoride)膜、Sephadex G-100为Amersham Biosciences产品；Ni-NTA购自 QIAGEN (德国)。其他试剂均为Ameresco公司产品。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆及重组表达载体的构建

根据 GenBank：D00861.1序列，利用 Primer Premier 5.0 软件设计引物。P1: 5′-CGCGGATCC ATGATTAAAGTATGGTTTTC-3′ (下划线部分为BamH I的酶切位点)；P2: 5′-CGGACTAGT TTAGCC TACAGCGTCAAAAG-3′ (下划线部分为Bcu I的酶切位点)。PCR程序：94℃预变性 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min ，72℃ 2 min；30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经胶回收纯化后，与克隆载体pMD19-T连接，构建克隆载体pMD-PPFE-I，阳性克隆委托上海生工公司测序。再用上述 2种限制性内切酶酶切重组质粒 pMD19-PPFE-I及 pET-DsbA表达载体后以 T4 DNA连接酶连接，转化 E. coli TOP10F′ 感受态细胞，在 LB平板上培养。挑取单个菌落，小量提取质粒，酶切及测序鉴定。

1.2.2 融合蛋白的诱导表达与可溶性分析

将重组表达质粒pET-DsbA/PPFE-I和对照质粒pET-DsbA转化大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS，分别挑取单克隆，接入20 mL含氨苄青霉素 (120 μg/mL)和葡萄糖 (0.2%) 的LB培养基，30℃、80 r/min振荡培养过夜。以2.5%接种量接入100 mL含氨苄青霉素 (120 μg/mL) 和葡萄糖 (0.2%) 的LB培养基，35℃、180 r/min振荡培养2~3 h至OD600为0.6时，加入IPTG至终浓度100 μg/mL，于30℃、180 r/min诱导表达，不同时间取样。离心收集各菌体细胞并超声破碎，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白的表达形式，并用纤维蛋白平板法测定其活性。

1.2.3 表达产物的纯化

将10 mL上清液上样于2 mL 的Ni-NTA亲和柱。层析柱预先用亲和缓冲液 (50 mmol/L PBS，0.3 mol/L NaCl，5 mmol/L咪唑，pH 7.4) 平衡10个柱体积，上样速度为1 mL/min。上样后用10个柱体积亲和缓冲液洗去未吸附的杂蛋白，再用5倍柱体积含有 30 mmol/L咪唑的亲和缓冲液洗脱杂蛋白。洗脱大部分杂蛋白后，用3~4倍柱体积的凝血酶缓冲液 (150 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，2.5 mmol/L CaCl2，pH 7.9) 平衡柱子，加入2 mL凝血酶缓冲液，再加入50~60 U 凝血酶，22℃酶切8 h后[8]，用约10 mL凝血酶缓冲液将酶切产物冲下，收集酶液，用纤维蛋白平板法测定其活性。活性样品用SDS-PAGE电泳检测，并进行蛋白含量的测定。

酶切后的目的蛋白经过Sephadex G-100凝胶过滤层析进一步纯化，用0.1 mol/L PBS (pH 7.4) 缓冲液洗脱，流速0.5 mL/min。收集目的峰，得到重组酶纯品，−70℃冻存。

1.2.4 纤溶酶活性测定

重组纤溶酶的纤溶活性检测参照文献[9]。

1.2.5 蛋白质浓度测定

采用Bradford法[10]，以牛血清白蛋白 (BSA) 为标准样品。

1.2.6 SDS-PAGE电泳检测

参照Laemmli UK报道的方法[11]进行，分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%。电泳完毕后，取出凝胶，考马斯亮蓝染色、脱色。

1.2.7 重组蛋白的Western blotting分析

蛋白纯化产物经SDS-PAGE电泳分离后，使用半干法将SDS-PAGE胶中融合蛋白转移至PVDF膜上，5 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗抗PPFE-I抗血清，4℃孵育过夜。PBST洗膜5次，每次10 min，再加入HRP标记的羊抗小鼠 IgG，37℃温育1 h，PBST洗膜3次后，ECL化学发光显色，压片。

1.2.8 MALDI-TOF-MS检测

根据 Kussmann的方法[12]对重组酶纯品进行MALDI-TOF (Time-of-Flight) 质谱分析。样品200 ng/μL，溶解于0.1% TFA，取10 μL与饱和溶解的70% ACN/30% 0.1TFA的介子酸等体积混合。由南京医科大学中心实验室测定。

2 结果

2.1 目的基因的克隆及重组表达载体的构建

以内生多粘类芽胞杆菌ESJ-3总DNA为模板，P1和P2为引物，进行PCR反应，扩增得到1 770 bp的DNA片段，与预期结果相符。PCR扩增片段的序列测定和分析表明，该序列编码区长1 770 bp，可编码 590个氨基酸，该基因编码的蛋白的分子量为63 414.58 Da；通过与其他纤溶酶的氨基酸序列比对 (图 1)，发现本研究得到的基因序列与 Bacillus pseudomycoides纤溶酶 (GenBank Accession No. ACK38255) 的亲缘关系最近，相似性达到 65%以上。构建好的重组表达质粒pET-DsbA/PPFE-I，经BamH I和Bcu I双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示2条DNA条带，一条与质粒 pET-DsbA相对分子质量相符，约为3 600 bp，另一条与 PCR产物相对分子质量一致，约为1 770 bp，证明重组表达质粒pET-DsbA/PPFE-I已构建成功，且DNA测序结果完全正确。

2.2 重组蛋白的诱导表达及可溶性分析

将重组质粒 pET-DsbA/PPFE-I和空质粒pET-DsbA分别转化E. coli BL21(DE3) 后，用IPTG进行诱导表达，不同时间取样进行SDS-PAGE分析。经IPTG诱导后，大量表达出分子量约为88 kDa的蛋白质，并且随诱导时间的增长其表达量增加(图2)。这与预测的融合蛋白大小相同，相当于24.7 kDa的DsbA和63.4 kDa的PPFE-I之和。经Bandscan软件分析显示，表达的目的蛋白占菌体总蛋白的18.4%。而对照菌pET-DsbA中没有出现这条带。同时，该表达蛋白存在菌裂解液的上清液中，而沉淀中没有出现表达区带 (图 3)，这说明该表达蛋白主要以可溶形式存在。

图1 Paenibacillus polymyxa EJS-3纤溶酶基因序列的进化树Fig. 1 Phylogenetic tree of PPFE-I gene.

图2 重组菌E. coli BL21(DE3)/pET-DsbA-PPFE-I诱导表达产物的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of expression products of E. coli BL21/pET-DsbA-PPFE-I. M: protein molecular weight marker; 1: E. coli BL21/pET-DsbA; 2: uninduced E. coli BL21/pETDsbA-PPFE-I; 3−6: E. coli BL21/pET-DsbA-PPFE-I induced by IPTG for 0.5, 1, 1.5 and 2 h, respectively.

图3 E. coli BL21(DE3)/pET-DsbA-PPFE-I表达产物的可溶性分析Fig. 3 Solubility analysis of E. coli BL21(DE3)/pET-DsbAPPFE-I expression products. M: protein molecular weight marker; 1: deposit after sonication and centrifugation of E. coli BL21(DE3)/pET-DsbA-PPFE-I; 2: supernatant after sonication and centrifugation of E. coli BL21(DE3)/pET-DsbA-PPFE-I.

用纤维蛋白平板测定表达产物纤溶活性。PPFE-I重组菌的发酵上清液在纤维蛋白平板上有明显的透明水解圈，说明表达产物具有纤溶活性，而含空载体重组菌为对照，其上清液无透明水解圈(图4)。纤溶活性测定结果表明，PPFE-I重组菌发酵上清液纤溶酶活性达228 IU/mL。

图4 纤维蛋白平板法测定纤溶活性Fig. 4 Fibrinolytic activity assay on fibrin plate. 1, 2: supernatant after sonication and centrifugation of E. coli BL21(DE3)/pET-DsbA; 3−8: supernatant after sonication and centrifugation of E. coli BL21(DE3)/pET-DsbA-PPFE-I, respectively.

2.3 表达产物的纯化和鉴定

经上述SDS-PAGE分析，表明pET-DsbA/PPFE-I重组质粒在大肠杆菌中可以实现可溶表达。上清液进行 Ni-NTA亲和柱纯化回收。纯化后的融合蛋白进行SDS-PAGE后转印PVGF膜，用抗PPFE-I抗体进行 Western blotting 鉴定。结果如图5所示，在88 kDa处有一条特异性条带，其大小与预测的融合蛋白是一致的，而E. coli BL21(DE3)/pET-DsbA细胞裂解液没有检测到任何条带，表明已经成功表达了目的蛋白。

图5 DsbA-PPFE-I Western blotting分析Fig. 5 Analysis of DsbA-PPFE-I Western blotting. 1, 2: purified fusion protein; 3: pET-DsbA.

上清液经 Ni-NTA亲和柱纯化时，杂蛋白大部分可被含有30 mmol/L咪唑的Binding Buffer洗脱，而融合蛋白不被洗脱，融合蛋白在镍柱上经凝血酶酶切 8 h后，收集酶液，用纤维蛋白平板法测定其有纤溶活性，并用SDS-PAGE电泳检测 (图6)。

图6 凝血酶酶切后的表达产物SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis of expression products by thrombin restriction. 1: recombinant enzyme with thrombin digestion; 2: protein molecular weight marker.

由图6可以看到，融合蛋白经凝血酶酶切后，除了63 kDa大小的重组酶，还有其他的杂蛋白存在，需经Sephadex G-100凝胶过滤层析进一步纯化，收集目的峰，得到比活力为2 051 IU/mg的重组酶 (图7)，用MALDI-TOF质谱鉴定纯度。质谱鉴定如图8所示，结果显示其单同位素峰平均相对分子质量为63 334，与预测的相对分子质量63 414基本一致。

图7 纯化产物的纤溶活性测定Fig. 7 Fibrinolytic activity assay of purified expression products on fibrin plate.

图8 重组酶的MALDI-TOF质谱图Fig. 8 MALDI-TOF mass spectrum of the recombinant fibrinolytic enzyme.

3 讨论

自从Nakamura等[13]于1992年首次克隆了纳豆激酶基因并测定了全基因序列，使得利用基因工程技术提高纤溶酶活性及产量成为可能。国内研究者们相继对纤溶酶基因如纳豆激酶 (NK)、豆豉溶栓酶基因的表达进行探索。本研究采用PCR方法克隆了内生多粘芽胞杆菌纤溶酶基因，其推导的纤溶酶氨基酸序列和已经报道的纳豆激酶、豆豉溶栓酶基因的氨基酸序列相似性只有 30%，与 Bacillus pseudomycoides (Genbank Accession No. ACK38255)纤溶酶相似性最高为65%，所以内生多粘芽胞杆菌纤溶酶可能是一种新型的纤溶酶。本研究克隆的基因序列编码的纤溶酶与已经报道的芽胞杆菌纤溶酶的性质差异尚需进一步探讨。

目前对纤溶酶基因表达的研究较多，主要以纤溶酶基因的原核表达系统为主，研究结果也不尽相同，主要在于纤溶酶基因表达后的产物是否有活性。本研究采用PCR方法克隆了内生菌多粘类芽胞杆菌纤溶酶基因，构建了pET-DsbA表达载体，采用T7启动子和 DsbA基因融合表达，将构建 pET-DsbA/ PPFE-I融合表达载体转化E. coli BL21(DE3) 后获得可溶性表达，表达的融合蛋白占菌体总蛋白的18.4%，纤维蛋白法测定显示纤溶活性，纤溶酶活性比野生菌高2倍左右，达228 IU/mL。表达量和酶活性与张淑梅[14]、Zhang[15]等研究的表达水平相近。本研究中，尽管表达产物以可溶性蛋白质形式表达，且具有纤溶活性，但融合蛋白表达量偏低。可能在于启动子强度和宿主菌的选择、质粒的拷贝数、培养条件的控制、mRNA 稳定性等几方面存在问题。此外，本研究中的P. polymyxa EJS-3纤溶酶氨基酸编码密码子存在6个稀有密码子，可能会对该基因在E. coli中的表达水平产生一定的影响。

金属螯合层析 (IMAC) 是近年来发展起来的蛋白质分离技术，通过在C端或N端添加标签的方法简化重组蛋白质的提取过程。本研究构建了pET-DsbA/PPFE-I的重组表达载体，在表达产物 N端融合了His-Tag纯化标签，故可利用Ni-NTA亲和柱来提纯表达出的融合蛋白，同时该载体在 DsbA编码区 3′端的下游有一凝血酶酶切位点，因此可用凝血酶在镍柱上将融合蛋白切割，酶切后得到目的蛋白和DsbA配体，经Sephedax G-100进一步纯化。通过镍亲和层析、凝血酶酶切以及分子筛层析对表达产物进行了纯化，操作简单易行，特别是将纯化与融合子的去除在Ni-NTA亲和柱上一步完成，大大简化了纯化步骤，为重组纤溶酶的生产提供了依据。

致谢：MALDI-TOF-MS分析结果是在南京医科大学中心实验室王富强老师的帮助下完成的，在此表示感谢。

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