DNA 聚合酶δ结合蛋白38是microRNA-291a-5p的一个靶基因

林德球，林辽华

华南师范大学生命科学学院，广州 510631

DNA 聚合酶δ结合蛋白38是microRNA-291a-5p的一个靶基因

林德球，林辽华

华南师范大学生命科学学院，广州 510631

DNA聚合酶δ结合蛋白38(DNA Polymerase delta-interacting protein 38，PDIP38)是2003年新鉴定的一个基因，目前认为其可能在DNA修复、有丝分裂以及血管平滑肌细胞迁移中起重要作用。根据本实验室前期在胚胎干细胞中对该基因的研究，认为microRNA可能在PDIP38的调控过程中发挥了重要作用。为证实这种推论，运用生物信息学方法预测发现在胚胎干细胞中高表达的microRNA——microRNA-291a-5p(miR-291a-5p)与PDIP38的开放阅读框(ORF)有一个配对非常理想的靶位点，通过构建该靶位点的报告基因载体以及ORF表达载体，分别进行荧光素酶报告基因分析以及细胞转染和Western blotting方法。结果证明miR-291a-5p能够直接调节PDIP38的蛋白表达。进一步运用real-time PCR和Western blotting分析证明了在胚胎干细胞中miR-291a-5p能够调节内源PDIP38的蛋白表达而对其mRNA表达无影响，这些都证明PDIP38确实是miR-291a-5p的一个靶基因。

microRNA，miR-291a-5p，PDIP38，胚胎干细胞

Abstract:DNA polymerase delta-interacting protein 38(PDIP38)was identified in 2003 as a human DNA polymerase delta interacting protein which plays important roles in DNA repair, mitosis and vascular smooth muscle cells(VSMCs)migration.Our previous study showed that PDIP38 was expressed in mouse embryonic stem(ES)cells and upregulated in protein levels after differentiation from ES cells, while the expression in mRNA levels was not changed.We supposed that microRNA played key roles in the regulation of PDIP38 and the differentiation of ES cells.By bioinformatics assay, we predicted that PDIP38 was a potential target of microRNA-291a-5p(miR-291a-5p).Futhermore, we validated the possibility of miR-291a-5p to regulate the protein expression of PDIP38.Using luciferase reporter assay, realtime PCR and western blot methods, we firstly demonstrated that miR-291a-5p directly inhibited the expression of PDIP38.The present results shed a new light on the study of PDIP38 and miR-291a-5p in the differentiation of ES cells.

Keywords:microRNA, miR-291a-5p, PDIP38, embryonic stem cell

MicroRNA(miRNA)是一类约22 nt的高度保守的非编码RNA分子。在动物中，miRNA主要以不完全配对的方式结合到靶基因 3′非翻译区(3′UTR)的多个互补位点，在转录后水平沉默其靶基因的表达。在植物中，miRNA主要以完全或几乎完全配对的方式结合到靶基因编码区的互补位点，引起mRNA降解[1-2]。

miRNA参与包括发育、分化、增殖、调亡和机体病变等多种生理过程，其异常表达会导致发育缺陷、癌症、肥胖、早老性痴呆等多种疾病的产生[3-6]。和许多 mRNA类似，miRNA的表达也具有时空特异性[3,7-8]。近年来的研究发现，miRNA在干细胞的自我更新、分化及其子代细胞的分化中发挥了重要的作用。在胚胎干细胞，精原干细胞和各种体组织干细胞中，miRNA也发挥了类似的功能[9-10]。

PDIP38是 DNA聚合酶 δ结合蛋白 38(DNA Polymerase delta-interacting protein 38)的缩写。PDIP38是一个新鉴定的基因[11]，因而目前的研究比较少。PDIP38可以和增殖性细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)结合[11]。PCNA也可以和DNA聚合酶δ结合。在DNA复制过程中，PCNA募集DNA聚合酶δ到DNA上修复损伤的DNA，以提高前导链的合成效率[12]。此外，PDIP38也和线粒体内DNA类核的一些组成蛋白结合，并且在整个有丝分裂的过程中，PDIP38都定位于有丝分裂的纺锤体[13-14]。最新的研究则证明PDIP38在血管平滑肌细胞(VMSCs)迁移中发挥关键作用[15]。在前期的研究中，我们在mRNA和蛋白水平上分别检测了小鼠胚胎干细胞中 PDIP38的表达，发现PDIP38在胚胎干细胞中有表达，同时在胚胎干细胞形成类胚体发生分化以后其蛋白表达水平显著增高，而mRNA水平则未见有明显的变化。根据对 PDIP38的初步研究结果，我们认为很可能miRNA在 PDIP38的表达调节中发挥了重要的作用。由此我们对PDIP38进行了miRNA结合位点的生物信息学预测，发现在 PDIP38的开放阅读框(ORF)末尾处有一个和 microRNA-291a-5p(miR-291a-5p)配对非常理想的靶位点，而有研究者已经证实 miR-291a的基因簇成员在胚胎干细胞中高表达，并且在细胞周期调节中具有重要作用[16-17]。

根据以上的研究背景和生物信息学预测的结果，我们认为miR-291-5a很有可能调节PDIP38蛋白的表达，进而影响胚胎干细胞的分化。通过荧光素酶报告基因分析、real-time PCR以及 Western blotting分析等方法我们证实了 PDIP38确实是miR-291-5a的一个靶基因。

1 材料与方法

1.1 载体构建

从小鼠的大脑 cDNA文库中扩增出 PDIP38的961～1 860 bp和1 101～1 860 bp两个片段以及它的ORF区域。分别克隆到 pMIR-REPORT载体(Ambion)的萤光素酶基因后面的XhoI位点和SacI位点之间以及C端带有Flag标签的pCDNA3.1载体的XbaI和SalI位点之间。具体如下，在50 μL体系中加入 5 μL 10× KOD Plus PCR buffer，5 μL 2 mmol/L 的 dNTPs， 2 μL 25 mmol/L MgCl2，20 μmol/L 的正反向引物各 1 μL，cDNA 模板 1 μL，KOD Plus 1 μL(TOYOBO)，用水补至 50 μL。PCR程序为：94℃变性 2 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃1 min，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物琼脂糖电泳后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海生工)回收目的条带。对于靶位点的克隆，回收片段及pMIR-REPORT用XhoI和Hind III(TaKaRa)双酶切，37℃消化2 h；对于ORF的克隆，PCR片段及载体用XbaI和SalI(TaKaRa)双酶切。酶切产物用PCR回收试剂盒(上海生工)回收。载体和片段的连接用T4 DNA连接酶(Fermentas)在16℃进行。连接产物转化到大肠杆菌 DH5α感受态细胞，挑阳性克隆用PCR进行鉴定，并送华大基因公司测序确认。用高纯度质粒小抽试剂盒(北京天根)提取转染级的质粒。扩增片段所用的引物见表1。

1.2 细胞培养及转染

报告基因分析采用的细胞为 293T细胞，用含10%胎牛血清(Invitrogen)的高糖 DMEM 培养基(Invitrogen)培养。采用小鼠胚胎干细胞 R1细胞系，进行Western blotting检测内源基因表达ES细胞培养在 0.1%明胶(Sigma)铺盘的经丝裂霉素(上海生工)处理后的单层小鼠胚胎成纤维(Mouse embryonic fibroblasts，MEF)细胞上，培养液成分为含有 10%胎牛血清(Gibco)、2 mmol/L 谷氨酸(Gibco)、0.1 mmol/L β-巯基乙醇(Gibco)、白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF，Chemicon公司)的 DMEM 培养液，每天换液，隔天传代。ES 细胞在0.1%明胶铺盘的皿中传代1次，以去除MEF 细胞。MEF 细胞的培养基为含10%胎牛血清的DMEM。转染前1天，接种到24孔培养板中。miRNA mimic及miRNA inhibitor(广州锐博生物科技有限公司)的转染终浓度为50 nmol/L。进行报告基因分析时，同时转入 50 ng/孔的pMIR-REPORT3-target+或 pMIR-REPORT3-target−，及20 ng/孔的pRL-TK。转染24 h后，进行荧光素酶活性，荧光定量PCR及Western blotting分析。本文中所用的转染方法为脂质体转染法，转染试剂为lipofectamine 2000(Invitrogen)，在293T细胞中的转染效率能够稳定在90%左右。

表1 文中所用的引物序列Table 1 The primer sequences in this study

1.3 报告基因分析

报告基因检测使用 Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)试剂盒在单管光度计Promega GloMax 20/20n上进行。实验操作按试剂盒及仪器的操作说明进行。具体如下，收获的细胞用PBS缓冲液清洗2次，在24孔板的每孔中加入100 μL PLB裂解液，室温下在摇床上温和摇动15 min。设定测试方案为双荧光检测，2个荧光的读值时间均为10 s。取20 μL细胞裂解液到1.5 mL的离心管中，加入100 μL LAR II底物，混匀，读取萤火虫荧光酶活性，随后加入100 μL Stop & Glo试剂，混匀，读取海肾荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为参照，计算萤火虫荧光酶的相对活性。

1.4 总RNA抽提及实时荧光定量PCR

收获24孔板中的细胞，吸去培养基，每孔加入200 μL Trizol(Invitrogen)，在摇床上混匀 10 min，将细胞裂解物转移到 1.5 mL的离心管中。加入40 μL氯仿，剧烈振荡 20 s，静止2 min。于4℃、12 000×g离心15 min，吸取上层水相转移到新的1.5 mL的离心管中，加入等体积异丙醇，室温沉淀30 min。12 000 r/min离心10 min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀1次，晾干，用无RNase的ddH2O溶解RNA，测定浓度。

取10 μg总RNA，用DNase I(Promega)处理30 min以消化基因组DNA，70℃灭活DNase I。取消化过的2 μg总RNA，加入0.5 μg随机引物，补水至10 μL，于70℃加热5 min，立刻置冰上冷却。随后加入反转录体系的其他试剂(5× 反转录缓冲液、dNTPs、RNase抑制剂(TaKaRa)及反转录酶M-MLV(Promega))。反转录在37℃进行1 h，然后于70℃灭活反转录酶。产物用Real-time PCR Master Mix(TOYOBO)进行实时荧光定量分析。引物序列见表1。

1.5 Western blotting分析

将收获的24孔板的细胞，每孔用40 μL 1× SDS加样缓冲液裂解，裂解液转移到1.5 mL的离心管中。裂解液样品用沸水煮10 min，随后高速离心10 min。样品电泳后，转印到 PVDF膜，用 BSA封闭膜。PDIP38的兔源多克隆抗体由瑞典卡罗林斯卡医学院细胞与分子生物学系的 Mario M.Müller教授惠赠。辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗购自北京天根生物工程公司。化学发光试剂为West Pico化学发光底物试剂盒(北京天根)。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 对PDIP38 mRNA上的miRNA结合位点进行生物信息学分析

鉴于PDIP38在小鼠胚胎干细胞R1以及其形成类胚体以后的表达变化，我们认为miRNA在胚胎干细胞分化过程中对 PDIP38蛋白表达有重要的调节作用。为了验证我们的假设，利用 microInspector软件对PDIP38基因能够结合的miRNA进行了预测分析。由于已有报道miRNA的靶位点除了位于3′ UTR外，也可以位于靶基因的编码框[18-19]，所以我们的预测也同时针对靶基因的编码框和非翻译区序列。如图1所示，miR-291a-5p和PDIP38的编码框接近 3′末端的一段区域有着高度的互补性，在miR-291a-5p的 1～11位碱基区域(种子区域为 2～8位碱基)更是完全配对。该靶位点的配对性相当稳定，自由能为−39.7 kcal/mol。并且在不同种属中，PDIP38的该区域附近都有这一个保守的靶位点序列。这说明，PDIP38很有可能是miR-291a-5p的一个靶基因。

2.2 荧光素酶报告基因分析 miR-291a-5p对PDIP38的调节

为了验证PDIP38是否确实能被miR-291a-5p调控，我们构建了2个报告基因载体，一个包含这一靶位点，一个则不包含，如图2A所示。将这2个报告质粒及化学合成的 miR-291a-5p共转染 293T细胞，发现带有这一靶位点的报告基因受到明显的抑制。而在加入了 miR-291a-5p的反义寡核苷酸后，报告基因的抑制受到明显的解除，如图2B所示。这说明miR-291a-5p可以与PDIP38上的这一靶位点结合进而抑制其蛋白表达。

2.3 Western blotting验证miR-291a-5p可以在蛋白水平调节PDIP38的表达

为了进一步证实，我们将 Flag融合的 PDIP38的完整 ORF和 miRNA或反义核酸共转染入 293T细胞。观察当靶位点位于ORF区域时，miR-291a-5p对PDIP38的调控是否仍然有效。如图3所示，当靶位点位于ORF区域时，miR-291a-5p仍然能够明显下调PDIP38的表达。这种抑制可被miR-291a-5p的反义核酸特异地逆转，使PDIP38的表达得以恢复。

图1 预测PDIP38 mRNA上miR-291a-5p的靶位点Fig.1 Predicted target site of miR-291a-5p on PDIP38 mRNA.(A)The base pairing between miR-291a-5p and its target site on PDIP38 mRNA.(B)The conservation of the miR-291a-5p target site.

图2 荧光素酶报告基因分析miR-291a-5p对PDIP38的调节(统计数据为3次独立实验的结果，每次实验重复1次，＊P＜0.05；＊＊P＜0.01)Fig.2 Identification of miR-291a-5p regulating the expression of PDIP38 by luciferase reporter assay.(A)The schematic diagram of the reporter plasmids with or without target site.(B)The regulatiuon of miR-291a-5p on the target site of PDIP38 mRNA analyzed by luciferase assay.miR-NC: negative control;AS: miRNA inhibitor(antisense).Data shown were±svalues from three independent experiments performed in duplicate(*P＜0.05; **P＜0.01).

图3 miR-291a-5p抑制外源的Flag标记的PDIP38的表达(统计数据为3次独立实验的结果，*P＜0.05)Fig.3 miR-291a-5p inhibitted the expression of exogenous Flag tagged PDIP38.Data shown were±svalues from three independent experiments(*P＜0.05).

2.4 在胚胎干细胞R1中证实miR-291a-5p可以调节内源性PDIP38蛋白的表达

最后，我们检测了胚胎干细胞系 R1内源的PDIP38表达是否也受miR-291a-5p调节。图4A表明在转染了miR-291a-5p以后，内源的PDIP38明显下调。而用反义核酸抑制了 miR-291a-5p以后，PDIP38的表达也显著回升。同时，PDIP38的mRNA则没有明显变化(图4B)。这说明miR-291a-5p是在转录后水平上抑制PDIP38的表达。

3 讨论

miRNA是近年发现的一类新的非编码调节性小RNA。研究发现miRNA广泛参与了生物体的各种生理过程。miR-291a-5p是在胚胎干细胞中特异表达的miRNA基因簇中的一个成员。高度的表达特异性表明这些 miRNA可能在维持胚胎干细胞和神经干细胞的低分化状态中发挥一定的作用。但是，目前为止这些miRNA的具体功能尚未得到证实。

图4 miRNA基因簇抑制内源PDIP38蛋白的表达差异Fig.4 The differentiation of inhibitted the protein of endogenous PDI38 by miRNA.(A)miR-291a-5p inhibitted the protein expression of endogenous PDIP38.(B)miR-291a-5p did not inhit the mRNA of PDIP38.Data shown were±svalues from three independent experiments(**P＜0.01).

miR-291a是从小鼠的胚胎干细胞中克隆到的一个miRNA基因簇成员，该miRNA基因簇约在2.2 kb以内，包含 7个 miRNA发夹结构——miR-290、miR-291a、miR-291b、miR-292、miR-293、miR-294和miR-295[10,16]。目前在大鼠中只发现有miR-290、miR-291a和miR-292，也是成簇分布的[15]。尚未在人类中发现这一miRNA簇的同源物。研究发现，此基因簇是胚胎干细胞和神经干细胞中特有的miRNA[16]。其中 miR-291a-3p、miR-291b-3p、miR-294、miR-295可促进因细胞周期的进程(从G1期转变到S期)，可能进而因此介导了干细胞的增殖[16,20]。最近的研究揭示miR-291-3p、miR-294、miR-295可以提高Oct4、Sox2、Klf4诱导的细胞重编程效率[20]。此外，人们对这一基因簇上的miRNA的功能还知之甚少。

PDIP38的功能目前还了解不多，已有的研究结果证明PDIP38可以和PCNA结合[11]，而PCNA在DNA复制过程中可以募集DNA聚合酶δ到DNA上，通过修复损伤的 DNA来提高前导链的合成效率[12]。此外，PDIP38在整个有丝分裂的过程中都定位于有丝分裂的纺锤体[13-14]。2009年Lyle等[15]的研究则证明 PDIP38可能是动脉粥样硬化和血管狭窄等血管疾病的新的治疗靶点，而这些功能都是通过影响血管平滑肌细胞中的活性氧水平以及动态细胞骨架重塑来实现的。

我们的前期研究结果发现 PDIP38在小鼠胚胎干细胞R1中有表达，在R1形成类胚体分化以后其蛋白表达显著升高，而其mRNA表达则无明显变化，这使我们想到了 miRNA可能在此分化过程中发挥重要作用。为了深入了解PDIP38在胚胎干细胞分化中的功能以及是否通过miRNA调节其蛋白表达，我们通过生物信息学方法预测到了胚胎干细胞中高表达的 miRNA——miR-291a-5p可能调节其表达，并首先在 293T细胞中通过荧光素酶报告基因以及Western blotting等方法证实了其能够显著抑制PDIP38蛋白的表达水平，而转染miR-291a-5p的反义核酸则能够逆转这种抑制作用。为了进一步确认此抑制作用，我们将 miR-291a-5p转染入胚胎干细胞R1中，同样证实了其对PDIP38蛋白表达的抑制作用。采用多种实验方法，针对内源表达和外源表达的PDIP38以及从过表达miRNA和抑制miRNA表达等多个角度的论证使我们更加明确了 miR-291a-5p对 PDIP38的抑制作用。我们推测，PDIP38和PCNA、DNA聚合酶δ以及纺锤体蛋白结合以后将发挥负调控 DNA合成、细胞分裂和细胞周期的作用。而在增殖旺盛的干细胞内，miR-291a-5p可能通过负调节PDIP38促进了DNA的复制、细胞分裂，进而维持了干细胞的高增殖能力。

综上所述，我们从多个角度证明了 PDIP38是miR-291a-5p的一个靶基因。这是到目前为止国际上鉴定的第一个 miR-291a-5p的靶基因。这一信息对于进一步了解PDIP38以及miR-291a-5p在胚胎干细胞分化以及细胞分裂和迁移中的功能提供了重要的线索。

REFERENCES

[1]Bartel DP.MicroRNAs: genomics, biogenesis,mechanism, and function.Cell, 2004, 116: 281−297.

[2]Brodersen P, Voinnet O.Revisiting the principles of microRNA target recognition and mode of action.Nat Rev Mol Cell Biol, 2009, 10: 141−148.

[3]Bushati N, Cohen SM.microRNA functions.Annu Rev Cell Dev Biol, 2007, 23: 175−205.

[4]Williams AE.Functional aspects of animal microRNAs.Cell Mol Life Sci, 2008, 65: 545−562.

[5]Schickel R, Boyerinas B, Park SM,et al.MicroRNAs: key players in the immune system, differentiation,tumorigenesis and cell death.Oncogene, 2008, 27:5959−5974.

[6]Kloosterman WP, Plasterk RH.The diverse functions of microRNAs in animal development and disease.Dev Cell,2006, 11: 441−450.

[7]Wienholds E, Plasterk RH.MicroRNA function in animal development.FEBS Lett, 2005, 579: 5911−5922.

[8]Landgraf P, Rusu M, Sheridan R,et al.A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing.Cell, 2007, 129: 1401−1414.

[9]Laurent LC.MicroRNAs in embryonic stem cells and early embryonic development.J Cell Mol Med, 2008, 12:2181−2188.

[10]Gangaraju VK, Lin H.MicroRNAs: key regulators of stem cells.Nat Rev Mol Cell Biol, 2009, 10: 116−125.

[11]Liu L, Rodriguez-Belmonte EM, Mazloum N,et al.Identification of a novel protein, PDIP38, that interacts with the p50 subunit of DNA polymerase delta and proliferating cell nuclear antigen.J Biol Chem, 2003, 278:10041−10047.

[12]Moldovan GL, Pfander B, Jentsch S.PCNA, the maestro of the replication fork.Cell, 2007, 129: 665−679.

[13]Cheng X, Kanki T, Fukuoh A,et al.PDIP38 associates with proteins constituting the mitochondrial DNA nucleoid.J Biochem, 2005, 138: 673−678.

[14]Klaile E, Kukalev A, Obrink B,et al.PDIP38 is a novel mitotic spindle-associated protein that affects spindle organization and chromosome segregation.Cell Cycle,2008, 7: 3180−3186.

[15]Lyle AN, Deshpande NN, Taniyama Y,et al.Poldip2, a novel regulator of Nox4 and cytoskeletal integrity in vascular smooth muscle cells.Circ Res, 2009, 105:249−259.

[16]Houbaviy HB, Murray MF, Sharp PA.Embryonic stem cell-specific MicroRNAs.Dev Cell, 2003, 5: 351−358.

[17]Wang Y, Baskerville S, Shenoy A,et al.Embryonic stem cell-specific microRNAs regulate the G1-S transition and promote rapid proliferation.Nat Genet, 2008, 40:1478−1483.

[18]Duursma AM, Kedde M, Schrier M,et al.miR-148 targets human DNMT3b protein coding region.RNA, 2008, 14:872−877.

[19]Tay Y, Zhang J, Thomson AM,et al.MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation.Nature, 2008, 455:1124−1128.

[20]Judson RL, Babiarz JE, Venere M,et al.Embryonic stem cell-specific microRNAs promote induced pluripotency.Nat Biotechnol, 2009, 27: 459−461.

DNA polymerase delta-interacting protein 38 is a target gene of microRNA-291a-5p

Deqiu Lin, and Liaohua Lin
College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China

Received:February 9, 2010;Accepted:May 20, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China(No.30430490).

Corresponding author:Deqiu Lin.Tel/Fax: +86-20-85211420; E-mail: lindq168@scnu.edu.cn国家自然科学基金(No.30430490)资助。